3討論
TCA循環(huán)是以乙酰輔酶A為底物，使用8種不同酶催化每一步反應(yīng)，最終生成草酰乙酸和2份的CO2(https://www.britannica.com/science/tricarboxylic-acid-cycle)。已有研究發(fā)現(xiàn)TCA反應(yīng)過程中酶的活性或中間產(chǎn)物的產(chǎn)生可調(diào)控細菌的生物被膜形成、多糖細胞間黏附素合成、持久性細胞形成及細菌毒力等。然而，與植物病原細菌TCA循環(huán)相關(guān)的研究報道則非常少，僅見到TCA循環(huán)可影響植物病原細菌丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas syringae pv.tomato)對擬南芥的毒力以及D.dadantii對大白菜和馬鈴薯的毒力。
在TCA反應(yīng)過程中，α-KGDH是催化α-酮戊二酸氧化脫羧反應(yīng)的關(guān)鍵酶，進而形成琥珀酰輔酶A和CO2，同時伴隨NADH的產(chǎn)生；α-KGDH缺乏會影響α-酮戊二酸向琥珀酰輔酶A的轉(zhuǎn)化。α-KGDH是一種由E1、E2和E3亞基共同組成的復(fù)合酶，其中E1亞基由sucA基因編碼。Zhao等]發(fā)現(xiàn)了sucA基因可影響多黏類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)對碳源的利用效率和菌株自身存活率。在E.coli中，sucA基因突變可直接影響與TCA循環(huán)相關(guān)的酶活性和胞內(nèi)代謝產(chǎn)物濃度；該基因在ymdB基因的調(diào)控下可下調(diào)表達，進而影響細菌生物被膜的形成、降低抗生素耐藥性。細菌生物被膜、耐藥性等細菌表型的變化表明了sucA基因與細菌毒力相關(guān)，Yi等研究也發(fā)現(xiàn)sucA基因的突變可顯著減弱蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)對昆蟲的毒力。然而，關(guān)于sucA基因作用于細菌毒力的研究仍然較少，特別是尚未見該基因在植物病原細菌中的生物學(xué)功能的相關(guān)報道。因此，本研究首次在植物病原細菌中開展了sucA基因的生物學(xué)功能研究，明確該基因?qū).zeae細菌毒力的影響可為進一步研究TCA循環(huán)調(diào)控細菌和寄主植物互作提供研究依據(jù)，并為植物病原菌致病機制提供新的見解。
本研究通過基因敲除突變和遺傳互補的功能驗證方法明確了sucA在香蕉細菌性軟腐病菌D.zeae MS1中可決定α-KGDH生成和活性的生物功能(圖2A)。在Dickeya中，D.zeae MS1與菊迪克氏菌(D.chrysanthemi)、D.dadantii、方中達迪克氏菌(D.fangzhongdai)和茄迪克氏菌(D.solani)的代表性菌株的SucA蛋白序列是高度保守的，相似性達到96%–97%。與溶果膠菌科的另一成員Pectobacterium菌株進行比對，發(fā)現(xiàn)D.zeae MS1的SucA蛋白序列與胡蘿卜果膠桿菌(P.carotovorum)和多功能果膠桿菌(P.versatile)的代表性菌株同樣具有較高的相似性(88%)。盡管SucA蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明Dickeya和Pectobacterium與腸桿菌目其他屬細菌具有明顯區(qū)別，D.zeae MS1與Klebsiella、拉烏爾菌屬(Raoultella)、Enterobacter、枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀菌屬(Shigella)、Escherichia、Erwinia和Edwardsiella等不同屬的代表菌株仍然具有較高的相似性(83%–89%)，D.zeae MS1與其他目的細菌如熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)則僅有中等相似性(59%)。這些表明sucA基因在包括E.coli在內(nèi)的腸桿菌目細菌中廣泛存在且較為保守，在該類細菌中可能具有相似的分子作用機制。本研究在Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變體庫中隨機篩選到多個插入到sucA基因不同位點而引起毒力顯著減弱的突變體；然而，關(guān)于sucA基因影響植物病原細菌毒力的研究也未見相關(guān)報道。因此，本研究需進一步分析sucA基因突變減弱細菌性軟腐病菌毒力與哪一類毒力因子相關(guān)。
在細菌性軟腐病菌重要毒力因子PCWDEs中，T2SS分泌的Pel和Cel是造成軟腐癥狀的“強大火力”，而T1SS分泌的Prt也可破壞植物細胞壁的完整性或者影響病原菌分泌蛋白的活性。在本研究中，sucA基因突變致使Pel、Cel和Prt均顯著減少分泌，該表型的變化可能是sucA基因突變體的毒力基本喪失的重要原因。已有研究表明，D.dadantii中編碼延胡索酸酶的fumA和編碼琥珀酸脫氫酶的sdhCDAB等TCA循環(huán)相關(guān)基因的突變可降低細胞內(nèi)c-di-GMP的產(chǎn)生并提高Pel的產(chǎn)生，該結(jié)果不同于本研究發(fā)現(xiàn)的sucA基因突變致使PCWDEs分泌顯著降低。對此，本研究比較了c-di-GMP合成關(guān)鍵酶二鳥苷酸環(huán)化酶(diguanylate cyclase,DGC)的編碼基因gcpA的轉(zhuǎn)錄水平變化，發(fā)現(xiàn)該基因在突變體與野生型間并未表現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)錄表達差異。在D.zeae中，DGC蛋白可通過調(diào)控整合宿主因子(integration host factor,IHF)來改變c-di-GMP水平，進而影響細菌的游動性和Pel與Prt的活性。然而，本研究發(fā)現(xiàn)sucA基因敲除突變體的細菌運動性并未與PCWDEs一樣受到影響，sucA基因敲除突變體的細菌涌動性和游動性與野生型均無明顯差異，均表現(xiàn)良好的細菌運動性。D.dadantii的fumA和sdhCDAB的基因突變可改變c-di-GMP的胞內(nèi)水平并影響其運動性，sucA基因的突變則并未影響c-di-GMP合成關(guān)鍵酶基因gcpA的表達和細菌運動性。因此，與fumA和sdhCDAB等TCA相關(guān)基因不同，sucA對PCWDEs分泌的影響應(yīng)是通過不同的作用途徑來實現(xiàn)。后續(xù)開展sucA影響D.zeae分泌PCWDEs的作用機制研究可進一步完善TCA循環(huán)調(diào)控細菌性軟腐病菌的生長和毒力等方面的基礎(chǔ)理論，并有助于制定細菌性軟腐病病害防控的新策略。
TCA循環(huán)主要受到可用底物的濃度和酶蛋白的變構(gòu)調(diào)節(jié)等方面的調(diào)控，在整個反應(yīng)過程中會產(chǎn)生多種不同的中間體且參與的酶也具有復(fù)雜多樣的功能。α-酮戊二酸是平衡碳代謝和氮代謝的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，α-酮戊二酸的積累是對氮限制的常見反應(yīng)。sucA基因的突變可引起α-酮戊二酸的積累，進而可能導(dǎo)致細菌體內(nèi)代謝異常。細菌代謝活動對其在寄主體內(nèi)定殖、侵染、致病至關(guān)重要，也是決定細菌毒力的關(guān)鍵因子。因此，sucA基因的突變所引起的細菌毒力顯著減弱應(yīng)該是多種毒力影響因素受到干擾引起的，包括PCWDEs和細菌代謝等。研究sucA影響D.zeae毒力因子PCWDEs分泌的作用機制可先探討α-酮戊二酸積累引起的代謝異常是否致使PCWDEs的分泌顯著減少。
4結(jié)論
本研究利用Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變體庫篩選到菌落表型變異較為一致且毒力顯著減弱的4個突變體，TAIL-PCR鑒定到該4個突變體均為插入sucA基因產(chǎn)生的。sucA基因的敲除突變致使細菌的α-KGDH活性完全喪失并顯著減少PCWDEs的分泌，進而降低細菌對煙葉的過敏性反應(yīng)和香蕉的致病性；與在D.dadantii中已報道2個TCA循環(huán)基因fumA和sdhCDAB的功能不同，sucA基因不引起PCWDEs的分泌增加，也不影響細菌的涌動和游動能力。因此，明確TCA循環(huán)相關(guān)基因?qū)τ诩毦玖Φ挠绊?，可為進一步完善細菌性軟腐病菌致病機制提供研究依據(jù)。
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