研究簡(jiǎn)介
隨著載人航天活動(dòng)的增加，微生物在太空環(huán)境中的適應(yīng)性變化成為航天醫(yī)學(xué)與空間生物學(xué)的關(guān)鍵議題。蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是航天器常見致病菌，可引發(fā)食物中毒及嚴(yán)重感染。本研究利用神舟八號(hào)飛船將B.cereus送入太空398小時(shí)，返回后綜合表型、基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)手段，首次系統(tǒng)評(píng)估短期太空飛行對(duì)該菌的影響，旨在揭示其潛在的毒力與耐藥性變化機(jī)制，為未來長(zhǎng)期載人任務(wù)中的生物安全提供依據(jù)。菌株搭載于神舟八號(hào)，同步地面溫控培養(yǎng)作對(duì)照。顯微鏡形態(tài)觀察、血瓊脂溶血實(shí)驗(yàn)、17種抗生素紙片擴(kuò)散藥敏試驗(yàn)、Biolog碳源利用譜及Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線測(cè)定。Illumina HiSeq 2000完成全基因組測(cè)序；RNA-seq獲得轉(zhuǎn)錄組；iTRAQ-2D-LC-MS/MS進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組；整合COG、GO、KEGG功能注釋與差異表達(dá)分析。兩株太空株（LCT-BC25、LCT-BC235）較地面株（LCT-BC244）生長(zhǎng)速率顯著降低；LCT-BC25對(duì)阿米卡星抑菌圈縮小50%，提示耐藥增強(qiáng)；碳源利用譜出現(xiàn)NaCl、甘露醇等差異。共檢出6個(gè)SNP（均為同義或基因間），且兩太空株均缺失一段約7基因的假定質(zhì)粒（與Citrobacter/E.coli質(zhì)粒同源），提示太空環(huán)境可誘導(dǎo)質(zhì)粒丟失。LCT-BC25、LCT-BC235分別差異表達(dá)1306/1455個(gè)基因、134/81個(gè)蛋白；功能集中于能量代謝（質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)、ATP合成）、脂肪酸及氨基酸代謝、結(jié)構(gòu)蛋白及毒力因子。其中LCT-BC235的非溶血腸毒素nhe顯著上調(diào)，提示短期飛行即可增強(qiáng)潛在毒力。短期太空飛行即可通過基因組精簡(jiǎn)（質(zhì)粒丟失）與轉(zhuǎn)錄-翻譯層面的代謝重編程，使B.cereus獲得生長(zhǎng)減緩、耐藥提高及毒力因子表達(dá)上調(diào)等適應(yīng)性變化。
Bioscreen全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用
使用Bioscreen C生長(zhǎng)曲線分析儀及其配套的Bio-link軟件監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)。該程序允許通過記錄光密度變化同時(shí)測(cè)量多達(dá)200個(gè)測(cè)試的生長(zhǎng)情況。蠟樣芽孢桿菌菌株在37℃的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。取20μl濃度為106CFU/ml的過夜培養(yǎng)物，在Bioscreen C(Lab Systems，Helsinki，F(xiàn)inland)的200孔微孔板(蜂窩培養(yǎng)板)中培養(yǎng)。平板以最大振幅持續(xù)振蕩，并在37℃下孵育24小時(shí)，每孔加入350μl新鮮LB生長(zhǎng)培養(yǎng)基。每小時(shí)測(cè)量600 nm處的光密度(OD)。同時(shí)設(shè)置一個(gè)僅含370μl LB的空白孔。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)兩株太空株在5小時(shí)后OD顯著低于地面株（P<0.05），直觀證實(shí)了太空飛行導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩的表型變化，為后續(xù)多組學(xué)機(jī)制研究提供了定量表型依據(jù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
隨著人類在空間站更長(zhǎng)時(shí)間的停留做準(zhǔn)備，關(guān)鍵的是更好地理解在太空獨(dú)特環(huán)境中可能誘導(dǎo)的各種微生物關(guān)系的變化。研究首次記錄了蠟樣芽孢桿菌在太空飛行期間發(fā)生的表型、基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組組合變化的分析。這些結(jié)果表明，片段丟失以及代謝、結(jié)構(gòu)和毒力的變化受到空間環(huán)境的影響。蠟樣芽孢桿菌是否能夠在太空飛行后變得更具毒力仍有待觀察，這是未來的一個(gè)研究領(lǐng)域。研究空間環(huán)境對(duì)微生物的影響將繼續(xù)是載人太空探索的重要組成部分，并將有益于空間微生物學(xué)。
圖1、所研究的三種蠟樣芽孢桿菌菌株的生長(zhǎng)曲線。通過在Bioscreen C中觀察到的生長(zhǎng)曲線比較顯示，兩個(gè)飛行株表現(xiàn)出比對(duì)照LCT-BC244顯著更慢的生長(zhǎng)速率，特別是在5小時(shí)后。
圖2、三種蠟樣芽孢桿菌菌株的全基因組同源性分析。
圖3、LCT-244支架5中潛在質(zhì)粒的物理圖譜。
圖4、LCT-235(A)和LCT-25(B)差異表達(dá)基因的COG功能分類。
圖5、LCT-235(A)和LCT-25(B)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的COG功能分類。
總結(jié)
空間環(huán)境可通過改變多種特征影響微生物，包括增殖速率、細(xì)胞生理學(xué)、細(xì)胞代謝、生物膜產(chǎn)生、毒力和耐藥性。然而，相關(guān)機(jī)制仍不清楚。為探索空間環(huán)境對(duì)蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的影響，一株蠟樣芽孢桿菌于2011年11月1日至2011年11月17日由神舟八號(hào)送入太空398小時(shí)。同時(shí)進(jìn)行了具有相似溫度條件的地面模擬作為對(duì)照。飛行后，使用表型、基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組技術(shù)進(jìn)一步分析飛行株和對(duì)照株，以探索蠟樣芽孢桿菌在空間環(huán)境中的差異。與地面對(duì)照株相比，飛行株表現(xiàn)出顯著更慢的生長(zhǎng)速率、顯著更高的阿米卡星耐藥水平以及代謝變化。太空飛行后，在飛行株LCT-BC25和LCT-BC235中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析，該分析顯示飛行株在代謝相關(guān)的基因/蛋白質(zhì)方面發(fā)生了變化。Bioscreen C生長(zhǎng)曲線分析儀量化太空環(huán)境對(duì)B.cereus增殖動(dòng)力學(xué)的影響。直觀證實(shí)了太空飛行導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩的表型變化，為后續(xù)多組學(xué)機(jī)制研究提供了定量表型依據(jù)。此外某些與結(jié)構(gòu)功能、基因表達(dá)修飾和翻譯以及毒力相關(guān)的基因/蛋白質(zhì)也發(fā)生了改變。我們的研究首次記錄了蠟樣芽孢桿菌在太空飛行期間發(fā)生的表型、基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組變化的分析，其結(jié)果可能對(duì)空間微生物學(xué)領(lǐng)域有益。
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