赤蘚糖醇(Erythritol)化學(xué)名稱為1，2，3，4-丁四醇，廣泛存在于水果、發(fā)酵食品中，甜度為蔗糖的70%～80%。能被小腸快速吸收，但90%沒(méi)有進(jìn)行代謝而排出體外，是在自然界中發(fā)現(xiàn)的相對(duì)分子質(zhì)量最小的糖醇，不僅擁有糖醇類產(chǎn)品所有的卓越功能，如防齲齒、適于糖尿病患者食用，還獨(dú)具熱量極低(≤1.66 kJ·g-1)和耐受量高(無(wú)副作用)的特性。赤蘚糖醇具有良好的食品加工適應(yīng)性和生理保健功能，作為一種新型功能性保健食品原料被廣泛用于食品、醫(yī)藥、化妝品及化工等領(lǐng)域。
赤蘚糖醇工業(yè)上主要是用耐高滲酵母或其它主產(chǎn)赤蘚糖醇的微生物發(fā)酵生產(chǎn)，選擇適宜的育種方法、選育赤蘚糖醇優(yōu)產(chǎn)菌株是生產(chǎn)的關(guān)鍵。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，1950年Binkey和Wolform首次提出酵母菌可以產(chǎn)生赤蘚糖醇。其后國(guó)內(nèi)外學(xué)者就產(chǎn)赤蘚糖醇菌株篩選進(jìn)行了大量研究。范光先等篩選出一株單產(chǎn)赤蘚糖醇的球狀酵母OS-194，Marimuthu等從污泥中篩選得到一株耐高滲酵母P.tsukubaensisKN75，吳燕等篩選得到一株圓酵母Torulasp.，Lin等從蜂蜜中篩選出一株菌Moniliellasp.440，以上菌株均是通過(guò)葡萄糖高滲法從自然界直接分離得到的。
作者通過(guò)對(duì)產(chǎn)甘油耐高滲酵母進(jìn)行紫外誘變處理產(chǎn)赤蘚糖醇，為赤蘚糖醇產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)量提高提供了一條新的途徑。
1實(shí)驗(yàn)
1.1材料、試劑與儀器
菌種：從自然界分離的產(chǎn)甘油耐高滲酵母CF4。
葡萄糖、濃硫酸，南京化學(xué)試劑有限公司；酵母膏，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈，汕頭市西隴化工廠有限公司。以上試劑均為分析純。
722型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天普儀器有限公司；1100型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司。
1.2培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20%，酵母膏1%，瓊脂2%，pH值5～6。
發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20%，酵母膏1%，尿素0.5%，pH值5～6。
種子培養(yǎng)基：葡萄糖20%，酵母膏1%，pH值5～6。
1.3方法
1.3.1菌株CF4生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
自新鮮的CF4斜面培養(yǎng)基挑取一環(huán)接種到液體種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r·min-1培養(yǎng)，每隔2 h取樣，離心，棄上清，收集菌體，將菌體重懸于蒸餾水中，反復(fù)2次，測(cè)定菌體密度OD600，以蒸餾水作為空白對(duì)照，繪制菌株CF4的生長(zhǎng)曲線。
1.3.2菌懸液的制備
自新鮮的CF4斜面培養(yǎng)基挑取一環(huán)接種到盛有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中，30℃、200 r·min-1培養(yǎng)10～18 h。取5 mL種子液，3000 r·min-1離心10 min，棄上清，菌體用生理鹽水洗滌2次，重懸于5 mL生理鹽水中制成菌懸液。
1.3.3紫外誘變處理
開(kāi)啟20 W紫外燈，預(yù)熱30 min，使波長(zhǎng)穩(wěn)定。將4 mL出發(fā)菌株的菌懸液分散于滅菌的培養(yǎng)皿中，在距紫外燈25 cm處，照射60 s、90 s、180 s、270 s、360 s，處理后的菌懸液被稀釋至1×10-6。吸取0.2 mL稀釋菌懸液涂布于含有培養(yǎng)基的平皿中，30℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。
1.3.4突變菌株的篩選
待單菌落長(zhǎng)出后，挑取菌落大、厚實(shí)的菌株分別接種到斜面培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h后，接種于30 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200 r·min-1培養(yǎng)3 d，用薄層層析和高效液相色譜定性，篩選出產(chǎn)赤蘚糖醇的菌株，然后按接種量8%移種于50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200 r·min-1培養(yǎng)5 d，用高效液相色譜測(cè)定赤蘚糖醇的產(chǎn)量，確定優(yōu)勢(shì)菌株。
1.4分析測(cè)試
1.4.1發(fā)酵液中赤蘚糖醇和葡萄糖定性分析(薄層層析法)
用毛細(xì)管分別將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在制好的薄層板上點(diǎn)樣，放在正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5的展開(kāi)劑中上行4～5 h后顯色，顯色劑為高碘酸鈉-聯(lián)苯胺溶劑，將薄層板從展開(kāi)缸中取出，烘干，浸入高碘酸鈉溶液中，取出后再浸入聯(lián)苯胺溶液中，烘干，觀察薄層板上變化。
1.4.2發(fā)酵液中赤蘚糖醇含量測(cè)定(高效液相色譜法)
色譜條件：色譜柱為L(zhǎng)ichrospher 5-NH2(4.6 mm×250 mm)；柱溫30℃；流動(dòng)相為乙腈-水(80∶10，體積比)；流速1.0 mL·min-1；示差折光檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為35℃。
測(cè)定方法：精密稱取赤蘚糖醇對(duì)照品0.5 g定容于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相制成50.00 g·L-1的儲(chǔ)備液，再將其稀釋為0.50 g·L-1、1.00 g·L-1、2.00 g·L-1、4.00 g·L-1、6.00 g·L-1、8.00 g·L-1和10.00 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。每一濃度分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定3次，取峰面積平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.4.3紫外誘變處理后致死率的測(cè)定
采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定致死率：將紫外誘變處理前、后的菌液分別用生理鹽水稀釋至1×10-6，各吸取0.2 mL涂布于含有培養(yǎng)基的平皿中，以未處理的菌液作對(duì)照，30℃培養(yǎng)48 h，單菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率。
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