1.10菌株HP-1降解有機磷農(nóng)藥降解譜的測定


為探討該菌株降解有機磷農(nóng)藥的降解譜，選取目前生產(chǎn)中常用的有機磷農(nóng)藥樂果、毒死蜱蜱、三唑磷、辛硫磷作為目標農(nóng)藥，按照1.9的方法進行試驗，培養(yǎng)7d，取樣用GC氣相色譜測定細菌對目標農(nóng)藥的降解率。


1.11菌株HP-1的發(fā)酵液的生物活性試驗


取無農(nóng)藥培養(yǎng)液，將其稀釋100倍[100×]和200倍[200×]，將蘿卜種浸泡6~8 h，取出用清水沖洗后稍微涼干，然后放入含有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿30粒，重復3次，于光照培養(yǎng)箱中28℃進行發(fā)芽試驗，分別計算第2d和第3d的種子發(fā)芽率。以清水處理和培養(yǎng)基100倍[100×]、200倍[200×]處理作為對照。


2結果與討論


2.1菌種鑒定


2.1.1菌落形態(tài)特征


經(jīng)過反復富集培養(yǎng)和雙層平板夾心法純化分離，獲得純化菌株18株，然后利用甲胺磷農(nóng)藥作為唯一碳源進行加壓選擇，選擇生長速度快、降解性能好的2個菌株作為目標菌株，其編號為HP-1和HP-2。以HP-1進行試驗，革蘭氏染色陰性G-，PSB雙層平板培養(yǎng)上，培養(yǎng)7d，形成紅色的圓形菌落，邊緣整齊光滑，中間稍稍突起，菌落直徑0.64~2.60mm。


2.1.2菌體形態(tài)特征

掃描電子顯微鏡下觀察，細菌單個細胞短桿形或彎曲桿形，(0.40~0.70)μm×(1.2~2.0)μm（圖1）；生長有趨光性，不對稱出芽分裂（圖2）；細胞靠極生鞭毛運動（圖3），有些或極少數(shù)細胞存在亞極生鞭毛。透視電子顯微鏡觀察切片，片層狀光合內膜位于細胞膜下并與之平行（圖4），細胞內細胞器濃縮成團。

2.1.3菌株HP-1的培養(yǎng)特征


富集培養(yǎng)時，培養(yǎng)液呈棕紅色。純化后在光照厭氧或微好氧條件下，培養(yǎng)液開始變渾濁，隨后培養(yǎng)液為淡紅色，對數(shù)生長期之后培養(yǎng)液變?yōu)轷r紅色或深紅色，培養(yǎng)時間過長，培養(yǎng)瓶底部可見菌體聚集成絮狀沉淀。


2.1.4菌株HP-1活細胞色素光譜吸收特性

菌株HP-1在有無農(nóng)藥處理的情況下，活細胞色素的吸收光譜特性明顯不同（如圖5和圖6所示）。在有無農(nóng)藥處理的情況下，二者在854、856、805 nm處理均有紅螺菌目葉綠素a的吸收峰，這與《伯杰氏細菌鑒定手冊第九版》所描述的相吻合。在388 nm處均有相同的吸收峰，但是在有農(nóng)藥加壓培養(yǎng)的情況下，在259~285nm之間活細胞的吸收峰值陡增，這與無農(nóng)藥處理的吸收峰完全相反，且無農(nóng)藥處理時吸收值比農(nóng)藥處理時明顯要低，該峰為類胡蘿卜素的吸收峰，說明用農(nóng)藥進行加壓選擇，菌株能夠以農(nóng)藥作為唯一的碳源生長，且明顯優(yōu)于對照并大量生產(chǎn)類胡蘿卜素，從而在農(nóng)藥處理時使活細胞的吸收峰值發(fā)生改變。

2.1.5菌株HP-1的生理生化特性


光合細菌菌株HP-1能夠利用多種有機化合物作為碳源生長和電子供體進行光照厭氧和微好氧生長。試驗結果表明：菌株HP-1能夠利用乙酸鈉、丙酸鈉、谷氨酸鈉、甘露醇、葡萄糖、葡萄糖酸鈉、蛋白胨、酵母浸膏、丙酮酸鈉、檸檬酸三鈉、果糖作為唯一碳源生長良好，但是不能夠利用酒石酸鈉、蘋果酸、丙二酸鈉、苯甲酸鈉等碳源。其中丙酸鈉、葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、檸檬酸三鈉、葡萄糖酸鈉，對HP-1菌株生長具有明顯的促進作用。

表1碳源生長情況碳源生長情況


甲酸鈉-山梨醇-


乙酸鈉+++甘露醇+


丙酸鈉+++葡萄糖+++


酒石酸鈉-蛋白胨+++


蘋果酸-酵母浸膏++


谷氨酰胺++甘油-


丙酮酸鈉+++檸檬酸三鈉+++


丙二酸鈉-乙醇+


苯甲酸鈉-果糖+++


甲醇-葡萄糖酸鈉++


谷氨酸鈉++對照-


注："+++"生長良好，"++"生長好，"+"能夠生長，"-"不能生長


Notes:"+++"growing rapidly,"++"growing well,"+"growing,"-"no growing


2.1.6菌體DNA的G+C摩爾分數(shù)的測定


按照熱變性溫度法，HP-1菌體的G+C摩爾分數(shù)為65.70%。


2.2不同濃度的甲胺磷對菌株HP-1生長的影響


從培養(yǎng)的第2d開始取樣，測定菌液OD660nm的值，連續(xù)4次。菌株HP-1在含有不同濃度農(nóng)藥的PSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，可明顯觀察到低濃度農(nóng)藥的生長速度快于高濃度的生長速度，且62.5~1 000mg/L之間對菌體生長的抑制作用不十分明顯，但是當濃度為2000mg/L和4000mg/L時，菌體生長明顯受到抑制，48h內4000mg/L中菌體根本不生長；當農(nóng)藥濃度過低（62.5mg/L），菌株生長速度相對較慢，可能是菌株生長的碳源供應不足所致；而125~2000mg/L為最佳生長濃度，菌株的對數(shù)生長期為96h，隨著農(nóng)藥濃度的提高，其對數(shù)生長期出現(xiàn)稍稍后延的現(xiàn)象，由于過高農(nóng)藥濃度，其生長對數(shù)期所需時間明顯向后推移（圖7）。


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