2.5地衣芽孢桿菌的抑菌特性研究
2.5.1與致病菌混合培養(yǎng)
由表5可知，地衣芽孢桿菌C30-2對金黃色葡萄球菌和傷寒沙門氏菌具有較強的殺滅作用。經24h培養(yǎng)后金黃色葡萄球菌活菌數為0，傷寒沙門氏菌的活菌數在共同培養(yǎng)后下降到4.60×103 CFU/mL。
表5混合培養(yǎng)試驗結果
2.5.2抑菌試驗
地衣芽孢桿菌C30-2的發(fā)酵上清液抑菌譜較廣,不僅對金黃色葡萄球菌、植物乳桿菌和魏氏梭菌等革蘭氏陽性菌具有抑制作用,同時對傷寒沙門氏菌、糞腸球菌和梅氏弧菌等革蘭氏陰性細菌也具有明顯的抑制作用(表6和圖5)。
圖5地衣芽孢桿菌發(fā)酵液上清對抑菌圈直徑的影響
表6地衣芽孢桿菌發(fā)酵液上清對常見致病菌抑菌結果
注:抑菌能力根據發(fā)酵上清液抑菌圈直徑判定;+表示抑菌圈直徑<10mm，++表示抑菌圈直徑10~15mm，+++表示抑菌圈直徑>15mm，-表示無抑菌作用。
3討論
地衣芽孢桿菌廣泛分布于自然界，可產生多種活性有益代謝物，能調整并治療菌群失調，還具有改善動物免疫系統的功能，使機體腸道免疫保持較高水平，是良好的免疫激動劑。本研究以環(huán)境土壤為篩選載體，初步分離出備選菌株，并經過嚴格篩選，確保了菌株的來源天然和健康。
飼料生產過程中調質和制粒等程序的溫度和壓力是制約微生態(tài)制劑中活菌數量的重要因素，也是影響活菌制劑質量的關鍵環(huán)節(jié)。此外，活菌在被動物采食后還要經過動物消化道中消化液消化才能抵達腸道，進而發(fā)揮益生作用。因此，本研究在篩選過程中同時兼顧了耐酸與耐膽鹽2個指標，結合溫度耐受性試驗，使篩選出的目標菌株不僅能耐受飼料加工過程中的惡劣環(huán)境，而且對胃酸和膽鹽等消化道環(huán)境具有較高的耐受性。一般仔豬飼料的制粒溫度為70~85℃，高溫處理后存活率低是菌種作為飼料添加劑的主要限制性因素之一。
從耐熱存活率看，C30-2在85℃處理10 min后存活率仍達93.33%，處理15min后存活率達24%，表明地衣芽孢桿菌C30-2耐熱性能較好，在飼料制粒加工過程中損失較少。同時，地衣芽孢桿菌C30-2在pH為3.0及2.5時活性均影響較小，且在膽鹽濃度0.3%、1%、2%下培養(yǎng)3h均出現輕微生長，因此C30-2若作為飼用益生菌進入動物消化道后能經受酸性環(huán)境和膽鹽的刺激，能夠成功達到腸道發(fā)揮其益生功能。益生菌能夠快速生長和增殖是其在動物消化道內發(fā)揮作用的重要前提和保障。地衣芽孢桿菌雖然不能長期定植于消化道內，但是卻也能在消化道內保留一段時間，因此更快速的繁殖能力是基礎。在本試驗中，觀察到地衣芽孢桿菌C30-2在培養(yǎng)5h之后就進入了對數生長期，通常乳桿菌和雙歧桿菌發(fā)酵進入對數生長期的時間在20h左右，其他研究報道的地衣芽孢桿菌也在12h左右，這說明本研究篩選得到的地衣芽孢桿菌C30-2有較快的生長速率。
金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌和大腸桿菌是極為常見的條件性致病菌，也是引起斷奶仔豬死亡的重要原因。本試驗中篩選獲得的地衣芽孢桿菌C30-2即對金黃色葡萄球菌抑制能力明顯增強;進一步研究證實了該菌株對金黃色葡萄球菌和傷寒沙門氏菌具有良好的抑制效果,并能夠抑制植物乳桿菌、魏氏梭菌和糞腸球菌、梅氏弧菌等細菌生長。這說明該株地衣芽孢桿菌能分泌高效的抑菌活性物質,具備抗腹瀉的益生潛力。已有研究表明，芽孢桿菌對斷奶仔豬具有保護作用，同時具有改善腸道健康和提高生長性能的作用。
研究發(fā)現，在日糧中添加0.75%芽孢桿菌制劑能提高斷奶仔豬腸道絨毛高度與隱窩深度的比值，增加盲腸短鏈脂肪酸(SCFA)水平，促進仔豬健康生長。經大腸桿菌K88處理后的斷奶仔豬,飼喂枯草芽孢桿菌后增加了其血清中IgA和IgG濃度，減弱了大腸桿菌引起的免疫反應，提高了平均日增重。仔豬腹瀉主要原因是由于仔豬面臨外界應激下導致的腸道屏障功能發(fā)生紊亂，出現腸黏膜受損、免疫系統失調等問題。Hung等發(fā)現，地衣芽孢桿菌發(fā)酵制品可顯著降低斷奶仔豬腹瀉發(fā)生率，并改善其糞便微生物區(qū)系組成?；潞Ａ盏仍谧胸i飼糧中添加地衣芽孢桿菌后，提高了脂多糖(LPS)應激下仔豬的腸黏膜抗氧化能力和免疫力，并促進腸道形態(tài)的修復，可減緩LPS應激導致的腸道損傷。另外，地衣芽孢桿菌也有提高斷奶仔豬飼料轉化效率和降低腹瀉率的趨勢，并能夠增加回腸的絨毛高度和結腸的隱窩深度，增加回腸和結腸中芽孢桿菌屬(Bacillus)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的豐度，還能提高結腸食糜中乙酸的含量，進一步說明地衣芽孢桿菌對于斷奶仔豬具有益生作用。這些結果都證實了地衣芽孢桿菌具有良好的益生性能，開發(fā)不同來源的地衣芽孢桿菌具有較大的發(fā)展空間和應用價值。
4結論
本研究以土壤為材料，分離并篩選出1株對金黃色葡萄球菌具有明顯抑制能力的地衣芽孢桿菌，并發(fā)現其在耐高溫、耐膽鹽和耐酸等方面具有較大優(yōu)勢，且抑菌效果優(yōu)良，是1株可用于微生態(tài)制劑生產的優(yōu)勢菌種。
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