1.3革蘭氏染色和接觸酶試驗
用無菌注射器吸取少量MRS肉湯培養(yǎng)物，滴在載玻片上，在酒精燈火焰上輕輕烘干固定。染色1min,水洗;滴加革蘭氏碘液媒染,作用1min,水洗;30s,水洗;滴加沙黃染色液復(fù)染1min，水洗。風(fēng)干后，在普通光學(xué)顯微鏡上觀察，菌體呈紅色為陰性，紫色的為陽性。選擇革蘭氏陽性形態(tài)一致的桿菌，進一步進行接觸酶試驗。具體步驟:取培養(yǎng)物約0.2mL注入裝有MRS瓊脂培養(yǎng)基斜面，37℃下培養(yǎng)24h，長出菌落后，將3%過氧化氫溶液滴加到菌落上，加瓊脂若沒有氣泡產(chǎn)生說明是陰性，若有氣泡產(chǎn)生說明是陽性。
1.4基因組DNA提取及16S rRNA測序分析
細菌總DNA采用細菌基因組DNA提取試劑盒[Tiangen DP302-02，天根生化(北京)科技有限公司]提取。16S rRNA擴增引物采用細菌通用引物，正向引物為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物為5'-CTA CGGCTACCTTGTTACGA-3'。PCR反應(yīng)體系(50μL):2μL模板DNA，正、反向引物(10pmol/μL)各2μL，4μL dNTP MIX,5μL Buffer,0.6μL TaKaRa ExTaq酶,用ddH2O將體系補充至50μL。PCR擴增程序:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min;58℃退火1 min;72℃延伸2min，進行30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段長度約1 500 bp的陽性產(chǎn)物經(jīng)純化后送中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司進行序列測定。得到的基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性比對，并利用本地軟件MEGA-X與模式菌種進行系統(tǒng)進化親緣關(guān)系研究，使用軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.5生理生化試驗
生理生化試驗包括氧化酶試驗、接觸酶試驗、糖醇發(fā)酵試驗、淀粉水解試驗和乳糖測定試驗，均參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的方法進行。結(jié)果分析參考《Microbiology:A Laboratory Manual》和《藥品微生物學(xué)檢驗手冊》。
1.6生長曲線測定
在錐形瓶內(nèi)裝300 mL MRS肉湯培養(yǎng)基。按1%接種量接種菌株培養(yǎng)物，37℃培養(yǎng)18h，以不加供試菌液的MRS液體培養(yǎng)基為空白對照，每隔1h測定其OD600，記錄數(shù)據(jù)并繪制生長曲線。
1.7抗逆性檢測
耐熱性能檢測:將待測菌株按2%(v/v)的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，分別于60、70、80℃水浴鍋內(nèi)處理10 min后，37℃培養(yǎng)24 h后，測定其活菌數(shù)。
耐酸性能檢測:將菌株按2%(v/v)的接種量接種到pH為2.0、2.5、3.0的MRS液體培養(yǎng)基中,分別在0、1、2、3h吸取菌液涂板,37℃培養(yǎng)24h后,測定其活菌數(shù)。
耐膽鹽檢測:將活化好的菌株用無菌生理鹽水做倍比稀釋，選取合適的稀釋梯度并吸取1mL稀釋液放于滅菌過的平皿內(nèi)。然后用含0.3%、1.0%、2.0%牛膽酸鈉的MRS固體培養(yǎng)基傾注平板，同時用不含牛膽酸鈉的MRS固體培養(yǎng)基作為對照組，37℃培養(yǎng)48h，進行菌落計數(shù)，并計算菌株的存活率。
抗生素抗性檢測:將各種抗生素溶解并濾菌后加入到滅菌的MRS培養(yǎng)基中，將菌株按2%(v/v)的接種量接種到含不同含量抗生素的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，觀察其菌落生長情況。試驗所用抗生素種類和使用量見表1。
表1抗生素種類和用量
1.8與致病菌混合培養(yǎng)試驗
將菌株用MRS肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h后，取5mL培養(yǎng)物與15mL營養(yǎng)肉湯混合，接種傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌K88和O157，接種量為培養(yǎng)液的10%，37℃培養(yǎng)24h，梯度稀釋后記錄各菌的活菌數(shù)。地衣芽孢桿菌采用MRS瓊脂培養(yǎng)基計數(shù)，各致病菌分別使用各自選擇性培養(yǎng)基進行計數(shù)，計算各平皿的菌落數(shù)，以平均值表示。
1.9抑菌試驗
將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌K88、大腸桿菌O157、傷寒沙門氏菌、化膿桿菌、梅氏弧菌、魏氏梭菌、藤黃球菌、肺炎鏈球菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌和酵母菌株用液體LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18h后，進行倍比稀釋，取合適稀釋度的1mL稀釋液傾注培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后將滅菌的不銹鋼牛津杯放到各指示菌培養(yǎng)基上，加入地衣芽孢桿菌發(fā)酵液無細胞上清液，每個樣品3個重復(fù)，并設(shè)MRS培養(yǎng)液為對照，37℃恒溫培養(yǎng),待出現(xiàn)明顯抑菌圈后,測定抑菌圈直徑。
1.10統(tǒng)計分析
數(shù)據(jù)用Excel 2016進行初步整理，采用SPSS22.0軟件進行頻數(shù)統(tǒng)計與描述性分析。
2結(jié)果
2.1菌株的鑒定試驗
試驗以北京市郊區(qū)農(nóng)田土樣為材料，
2.2生理生化試驗結(jié)果
由表2可見，進一步確定篩選出的C30-2菌株為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。
表2 C30-2生理試驗結(jié)果
2.3地衣芽孢桿菌的生長曲線
由圖2可見，在培養(yǎng)第5小時，菌株生長進入對數(shù)期，此時活菌數(shù)開始迅速上升，在第12小時進入穩(wěn)定期，并于第16小時活菌數(shù)達到最大6.6×109 CFU/mL。
2.4地衣芽孢桿菌的抗逆性檢測
2.4.1耐熱性能檢測
由表3可見，在85℃處理10 min后，C30-2的存活率高達93.33%;處理15min，菌株存活率仍有24%。這一結(jié)果表明該菌株耐熱性能較好。
2.4.2耐酸性能檢測
從圖3可以看出，pH為3.0和2.5時對地衣芽孢桿菌活性影響較小，而當(dāng)pH為2.0時活菌數(shù)發(fā)生明顯下降。
2.4.3耐膽鹽性能檢測
如圖4所示，地衣芽孢桿菌C30-2對膽鹽具有良好的耐受能力，在各膽鹽濃度下培養(yǎng)3h仍可繼續(xù)生長。
2.4.4抗生素抗性性能檢測
地衣芽孢桿菌對喹喹乙醇、乙酰甲喹、速大肥、泰樂菌素、三甲氧芐氨嘧啶、吉他霉素敏感，而對牛至油、洛克沙砷、桿菌肽鋅和阿散酸。
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