摘要
為了解我國牛結(jié)節(jié)性皮膚病(lumpy skin disease，LSD)田間毒株流行情況及遺傳進(jìn)化情況并觀察其生物學(xué)特征，本研究對(duì)臨床疑似發(fā)生牛結(jié)節(jié)性皮膚病的牛皮膚結(jié)節(jié)樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)、病毒分離、免疫熒光鑒定、電鏡觀察、GPCR基因測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明：利用原代羊睪丸細(xì)胞(PLT)分離得到3株牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(LSDV)，分別命名為L(zhǎng)SDV/Heilongjiang/2022株、LSDV/Jiling/2022株和LSDV/Jiangxi/2022株，對(duì)三株病毒進(jìn)行一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定，前96 h病毒增長(zhǎng)速度最快，96~120 h時(shí)滴度最高，之后病毒生長(zhǎng)速度開始減緩，接種96 h后滴度最高，三株病毒分別可達(dá)到106.0 TCID50·mL-1、105.3 TCID50·mL-1和105.1 TCID50·mL-1。透射電鏡下病毒粒子呈橢圓形，病毒直徑為200~300 nm。將三株病毒GPCR基因序列與中國各地區(qū)以及近年其他國家流行毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，三株分離株與中國各地區(qū)毒株均處于同一分支上，說明中國各地區(qū)牛結(jié)節(jié)性皮膚病的流行有很強(qiáng)的相關(guān)性。本研究成功從黑龍江、吉林及江西三省牛皮膚結(jié)節(jié)病料中分離出三株LSDV，豐富了我國LSDV的流行病學(xué)及病原學(xué)數(shù)據(jù)，并對(duì)LSDV的持續(xù)監(jiān)測(cè)與新型疫苗研發(fā)工作有參考意義。
牛結(jié)節(jié)性皮膚病(lump skin disease，LSD)又稱牛疙瘩性皮膚病、牛結(jié)節(jié)性皮炎、牛塊狀皮膚病。是由痘病毒科(Poxviridae)，山羊痘病毒屬(Capripoxvirus，CaPV)的牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(lump skin disease virus，LSDV)引起的牛全身性傳染性疾病。LSDV是帶囊膜的線性雙鏈DNA病毒，該病毒只有一個(gè)血清型。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)將其列為必須通報(bào)的疫病，我國于2019年8月12日在新疆伊犁首次發(fā)現(xiàn)該病，目前將其列為二類動(dòng)物疫病。牛結(jié)節(jié)性皮膚病主要傳播媒介是吸血節(jié)肢動(dòng)物，潛伏期長(zhǎng)達(dá)28 d，特點(diǎn)是發(fā)熱、淋巴結(jié)節(jié)腫大、皮膚黏膜結(jié)節(jié)性病變、皮膚水腫，結(jié)節(jié)破潰后可長(zhǎng)達(dá)數(shù)月不愈。此病的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致奶?；既榉垦撞⑶耶a(chǎn)奶量暫時(shí)減少，動(dòng)物體重增加緩慢，公牛不孕不育等，造成較大經(jīng)濟(jì)損失。LSDV在很長(zhǎng)一段時(shí)間中僅存在于南非地區(qū)，此后逐漸向非洲東部和北部擴(kuò)散，2012年以來LSD迅速擴(kuò)散至整個(gè)亞洲以及歐洲地區(qū)，包括俄羅斯、土耳其、孟加拉國、印度、越南、蒙古國以及泰國等國家，并于2019年傳入中國，2020年傳至東南亞國家。
LSDV與綿羊痘病毒(SPV)、山羊痘病毒(GPV)基因序列相似性達(dá)到96%~97%，僅在基因組末端的某些毒力基因和宿主嗜性功能基因上存在一定程度的序列差異。P32蛋白是LSDV囊膜表面一種主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有主要抗原表位，是羊痘病毒屬最主要免疫原性基因，能在病毒感染的初期刺激宿主產(chǎn)生抗體阻止病毒擴(kuò)散，但該抗體無法阻止病毒在攻毒部位的復(fù)制。研究人員在對(duì)P32蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，羊痘病毒屬中P32蛋白與其它痘病毒屬的一樣，擁有比較高的同源性，是所有LSDV的分離株中共有的特異性高、免疫原性強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白，研究表明其體外表達(dá)產(chǎn)物可用于建立血清學(xué)診斷技術(shù)。GPCR基因(G-protein-coupled chemokine receptor)屬于趨化因子家族，與痘病毒中位于基因組左端的單拷貝基因——Q2/3L為同源基因，在病毒感染宿主后，可影響宿主的免疫反應(yīng)，與病毒宿主嗜性有關(guān)。在不同CaPV的成員中會(huì)各自發(fā)生不同位點(diǎn)的變異，可以以此來對(duì)SPPV、GTPV、LSDV進(jìn)行分組鑒定，此外該基因還可以應(yīng)用于LSDV野毒株和疫苗株的區(qū)分。
目前我國已有14個(gè)省份正式報(bào)告和記錄了LSD疫情。LSD的暴發(fā)主要在中國東南部，包括安徽、浙江、江西、福建、廣東、廣西、香港、四川和臺(tái)灣等地，多數(shù)地區(qū)LSD流行株的病原學(xué)特征和流行病學(xué)情況仍有待研究。
本研究采集來自黑龍江、吉林以及江西三省2022年臨床發(fā)病牛皮膚結(jié)節(jié)樣品進(jìn)行病毒分離鑒定，并對(duì)GPCR基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，以了解當(dāng)前LSDV的流行情況。
1材料與方法
1.1樣品采集以及處理
采集黑龍江、吉林和江西三省的疑似LSDV感染牛皮膚結(jié)節(jié)組織樣品，剪碎后加入適量無菌PBS溶液勻漿混勻，制成約10%組織勻漿，雙抗4℃作用7 h并反復(fù)凍融3次，5 000 g離心10 min后棄沉淀，取上清液用0.45μm過濾器過濾，收集濾液置于-80℃冰箱，用于后續(xù)試驗(yàn)。
1.2主要試劑、儀器及細(xì)胞
Phanta Max Master Mix(Dye Plus)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；特級(jí)胎牛血清(FBS)購自北京綠源伯德生物科技有限公司；DNA Marker DL500購自TaKaRa公司；DMEM/F-12為Gibco公司產(chǎn)品；病毒DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG購自Sigma-Aldrich?公司；倒置熒光顯微鏡(DMi8)購自Leica公司；PCR儀(847-x-070-724)購自analytik-jena公司；原代羊睪丸細(xì)胞(PLT)為本實(shí)驗(yàn)室制備。
1.3組織樣本PCR檢測(cè)
按天根生物試劑盒說明書提取病料核酸，并于-20℃保存。參照《OIE陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊(cè)2021第8版》使用病毒黏附蛋白(P32)編碼基因特異性引物L(fēng)SDV-F/R進(jìn)行PCR檢測(cè)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。
表1本研究所用引物信息
25μL PCR反應(yīng)體系：Phanta Max Master Mix(Dye Plus)12.5μL，DNA模板1μL，上、下游引物(10 pmol·μL-1)各1μL，雙蒸水補(bǔ)至25μL，充分混勻。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，48℃退火15 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。
1.4病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)及其TCID50測(cè)定
將PCR檢測(cè)為L(zhǎng)SDV陽性的病料上清接種于原代羊睪丸細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)一周，每天觀察并記錄細(xì)胞的CPE現(xiàn)象，若無CPE現(xiàn)象繼續(xù)盲傳，直至出現(xiàn)CPE現(xiàn)象。收集出現(xiàn)CPE現(xiàn)象的細(xì)胞上清，使用P32蛋白基因的引物L(fēng)SDV-F/LSDV-R進(jìn)行PCR鑒定，引物序列見表1。將收集的細(xì)胞上清按照10-1~10-8進(jìn)行倍比稀釋，并接入96孔板中按照Reed-Muench法計(jì)算TCID50值。
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