摘要胞外DNA在土壤中的長期留存已得到充分證實，但其對微生物多度與多樣性分析的干擾卻仍存爭議。這一爭議可能主要源于有關(guān)現(xiàn)有活體微生物研究方法可靠性的認知局限。本研究基于在中國西部地區(qū)所采集的土壤樣品，系統(tǒng)比較了堿性緩沖液洗滌、疊氮溴化丙錠（PMA）處理、DNase預消化和rRNA直接表征等4種常用方法在表征土壤活體原核生物群落方面的表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)：胞外DNA的去除顯著影響了原核生物多度、多樣性、群落結(jié)構(gòu)和共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的解析，但對群落構(gòu)建機制解析的影響近乎可以忽略。不同研究方法所表現(xiàn)出的影響卻同樣顯著差異：相比于基于總DNA的研究，DNase預消化與PMA處理顯著降低了原核生物多度，基于堿性緩沖液洗滌與rRNA直接表征法的分析則未觀察到顯著差異；DNase預消化顯著降低了物種豐富度，rRNA直接表征法則增加了原核生物豐富度。盡管67.8%的擴增子序列變體（ASVs）為共有類群，但基于不同方法所表征的各微生物類群的相對多度存在顯著差異。此外，胞外DNA去除降低了共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的復雜性，卻增強了網(wǎng)絡(luò)的魯棒性。DNase預消化展現(xiàn)出最高的DNA去除效率與活體微生物表征準確性，而其他方法卻存在去除效率低、結(jié)果穩(wěn)定性差或相關(guān)結(jié)果解釋的不確定性高等問題。本研究表明不同方法所表征的活體原核生物群落存在顯著差異，推薦使用DNase預消化法進行土壤活體原核群落研究，這為優(yōu)化微生物組研究方法提供了重要指導。
引言
土壤微生物作為生物地球化學循環(huán)的核心驅(qū)動者，在維持生態(tài)系統(tǒng)功能與健康中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當前的研究主要依賴于擴增子測序、宏基因組分析、基因芯片和定量PCR等技術(shù)。值得注意的是，源于裂解微生物的細胞外DNA可在土壤中持續(xù)存在數(shù)周至數(shù)年，占土壤總DNA庫的近40%。其存在的時間受溫度、濕度、pH和有機質(zhì)等環(huán)境因子調(diào)控：低溫與高有機質(zhì)含量能夠延緩降解，而高溫高濕的環(huán)境則會加速分解。然而現(xiàn)行微生物分析多基于總DNA提取，其結(jié)果可能受胞外DNA的干擾。因此，消除胞外DNA的潛在影響成為當前土壤微生物組學研究的重要挑戰(zhàn)。為應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，研究人員開發(fā)了一系列方法來研究活體微生物，包括堿性緩沖液洗滌、疊氮溴化丙錠（PMA）處理、DNase預消化和rRNA直接表征等。其中堿性洗滌能有效去除胞外DNA，曾是研究活體微生物最常用的方法。
PMA在可見光下與胞外DNA形成不可逆的共價交聯(lián)，從而抑制后續(xù)PCR擴增，而活體細胞憑借完整膜結(jié)構(gòu)可排斥PMA進入，使其DNA得以提取和擴增，近年來PMA處理法在研究土壤活體微生物多度和多樣性方面得到了廣泛應(yīng)用。DNase I作為去除胞外DNA的另一種有效方法，主要通過水解磷酸二酯鍵降解胞外DNA，也常被用于土壤活體微生物組研究。此外，因rRNA在胞內(nèi)含量高，且在環(huán)境中極不穩(wěn)定，已有學者提出，rRNA表征法也可用于研究活體微生物群落?？傊@些方法原理迥異，可能對活體微生物群落解析產(chǎn)生顯著有影響。
事實上，關(guān)于胞外DNA對微生物多樣性分析的影響，不同方法的研究結(jié)論存在矛盾。例如，基于PMA處理的多項研究都觀察到胞外DNA顯著影響了土壤微生物多樣性。相比之下，一項基于DNase預消化法的研究則未觀察到胞外DNA對土壤細菌多樣性的顯著影響。因此，比較和評估解析土壤活體微生物的常用方法是土壤微生物學領(lǐng)域的迫切需要。目前，已有一些研究初步評估了相關(guān)方法在研究土壤活體微生物多度和多樣性方面的效率。然而，相關(guān)研究主要集中于基于純培養(yǎng)菌株或針對有限數(shù)量環(huán)境樣本的單一方法。
目前，尚未有基于大尺度環(huán)境樣本對土壤活體微生物研究方法進行系統(tǒng)的比較和評估。因此，本研究基于在中國西部采集的土壤樣本，系統(tǒng)地比較和評估了研究活體微生物群落的堿性緩沖液洗滌法、PMA處理法、DNase預消化法和rRNA直接表征法等4種常用方法。樣點的海拔、年均溫和年均降水量范圍分別為21~4618 m、-6.04~21.83℃和40.7~1565.1 mm。測定并比較了基于不同方法所表征土壤原核生物的多度、多樣性、共現(xiàn)模式和群落構(gòu)建機制。
此外，還通過標簽DNA添加實驗評估了各方法的胞外DNA去除效率，并采用模擬群落驗證了各方法在表征活體群落方面的可靠性。本研究重點驗證了“不同方法在表征活體原核生物多度與多樣性方面存在顯著差異”這一核心假設(shè)。
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