1.2.4生長曲線和時(shí)間殺菌曲線的測定
將沒食子酸添加到腐敗希瓦氏菌菌懸液(105CFU/mL)中，使其最終濃度為MIC，于28℃、110 r/min條件下培養(yǎng)。以未添加沒食子酸的菌液為對照組。每隔2 h用酶標(biāo)儀測定OD595 nm值，每組重復(fù)3次，取平均值，繪制腐敗希瓦氏菌生長曲線。每隔2 h吸取各組培養(yǎng)液200μL，進(jìn)行平板活菌菌落計(jì)數(shù)并繪制時(shí)間殺菌曲線。
1.2.5掃描電鏡
取一定量已培養(yǎng)的腐敗希瓦氏菌菌懸液，于3 000 r/min離心10 min，棄去上清液。將菌體用0.1 mol/L PBS(pH=7.4)清洗2次，于3 000 r/min離心10 min，再用PBS稀釋，使菌懸液OD595 nm≈0.5。將沒食子酸添加到菌懸液中，使其終濃度為MIC，置于28℃震蕩培養(yǎng)(161 r/min)12 h。以未添加沒食子酸的菌液為對照組。將各組培養(yǎng)液于3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用無菌水清洗2次。將菌體與20 mL 2.5%的戊二醛溶液混勻，固定處理2 h。無菌水清洗2次后，分別在50%，70%，80%，90%的乙醇中浸泡30 min，在100%的無水乙醇中浸泡1 h進(jìn)行逐級脫水。取適量菌懸液于蓋玻片上，37℃下干燥72 h。將菌體進(jìn)行噴金處理，采用掃描電鏡對菌體微觀形貌進(jìn)行表征分析。
1.2.6細(xì)胞凋亡測定
細(xì)菌前處理參照1.2.5，置于28℃震蕩培養(yǎng)(161 r/min)12 h后，將培養(yǎng)液于1 000 r/min離心5 min，棄上清液，0.1 mol/L PBS(pH=7.4)清洗2次，于1 000 r/min離心5 min，棄上清液。菌體用1 mL PI染液染色，于4℃避光放置30 min。1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。
1.2.7細(xì)菌核酸泄漏測定
細(xì)菌前處理參照1.2.5，置于28℃震蕩培養(yǎng)(161 r/min)12 h后，用0.22μm濾膜過濾菌懸液，用酶標(biāo)儀測定濾液在260 nm波長下OD值，每組重復(fù)測定3次。
1.2.8細(xì)菌蛋白泄露測定
細(xì)菌前處理參照1.2.5，置于28℃震蕩培養(yǎng)(161 r/min)12 h后，用BCA蛋白檢測試劑盒對菌懸液蛋白濃度進(jìn)行測定。
1.2.9電導(dǎo)率測定
細(xì)菌前處理參照1.2.5，置于28℃震蕩培養(yǎng)(161 r/min)，每間隔10 min用電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率，直至電導(dǎo)率值達(dá)到平衡值。
1.2.10統(tǒng)計(jì)分析
采用Excel 2010及Origin 8.5軟件處理數(shù)據(jù)和生成圖表，數(shù)據(jù)為重復(fù)3次所得的平均值，用SPSS 19.0(統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性，顯著性水平為P<0.05。
2結(jié)果與分析
2.1酚酸對腐敗希瓦氏菌的抑制活性
沒食子酸、原兒茶酸和綠原酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌直徑見表1。抑菌直徑最大的為7.5 mg/mL的沒食子酸，最小的為5 mg/mL的綠原酸，而2.5 mg/mL綠原酸幾乎沒有抑菌圈出現(xiàn)。3種酚酸的抑菌直徑均隨抑菌劑濃度的增加而增大，表明酚酸抑菌活性與其濃度呈正比。同等濃度的沒食子酸、原兒茶酸和綠原酸中，沒食子酸的抑菌直徑均為最大，其次是原兒茶酸。表明3種酚酸對水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌抑菌活性從大到小依次為沒食子酸>原兒茶酸>綠原酸。
表1酚酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌圈直徑
采用肉湯二倍稀釋法測定不同酚酸的MIC和MBC的數(shù)值，進(jìn)一步比較各個(gè)酚酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌能力。沒食子酸對腐敗希瓦氏菌的MIC為1.25 mg/mL，MBC值為2.5 mg/mL，與其他兩種酚酸相比，MIC和MBC值均最低(表2)，表明其具有較強(qiáng)的抗菌活性。李建科等研究了不同細(xì)菌對沒食子酸的抑制效果，研究表明沒食子酸對金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的MIC分別為2，4，4，4 mg/mL。表明沒食子酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌效果比對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等細(xì)菌的好。
表2酚酸對腐敗希瓦氏菌的最小抑菌濃度及最小殺菌濃度
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