為此，他們優(yōu)化了一個大腸桿菌表達系統(tǒng)，表達了一個BA轉(zhuǎn)運蛋白基因baiG以增加BA吸收，并刪除了內(nèi)源性7α-HSDH基因以避免干擾。通過從統(tǒng)一的人類和哺乳動物胃腸道蛋白質(zhì)目錄（UHGP/UMGP）中篩選候選HSDH基因，并使用EFI-EST工具構(gòu)建序列相似性網(wǎng)絡(luò)，最終選擇了207個候選基因進行表達。在初步篩選中，發(fā)現(xiàn)其中74個基因表現(xiàn)出BA HSDH活性。通過向含有功能性HSDH基因的大腸桿菌文庫中添加46種BA標準品并使用液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）監(jiān)測其轉(zhuǎn)化過程，確定了新形成的膽汁酸相關(guān)質(zhì)譜峰是否為先前未充分表征的膽汁酸，并基于其代謝功能和底物特異性分配其身份。
2.腸道菌群編碼未被充分表征的膽汁酸羥基類固醇脫氫酶，這些酶可產(chǎn)生較少被研究的膽汁酸異構(gòu)體
接著研究人員通過對74個HSDH基因（其中59個為首次報道）的功能篩選，鑒定了56種此前未被充分描述的膽汁酸異構(gòu)體，并通過核磁共振（NMR）驗證了這些化合物的身份及相應(yīng)HSDH的氧化還原功能。研究發(fā)現(xiàn)，盡管這些HSDH具有相似的催化功能，但其蛋白質(zhì)序列多樣性顯著，例如Enterocloster clostridioformisATCC 25537中的3α-HSDH（MBHC01/XMLSchema）與Bacteroidales bacterium22bG中的另一個3α-HSDH（MBHC043）僅有19%的序列相似度。此外，HSDH基因能夠代謝廣泛的膽汁酸底物，轉(zhuǎn)化效率從2%到超過90%不等，顯示出對不同位置和方向羥基的選擇性。這些HSDH廣泛分布于人類腸道細菌中，超過40%的人類腸道細菌物種至少攜帶一個與HSDH同源的基因。進一步分析顯示，這些未充分表征的BA異構(gòu)體在哺乳動物糞便樣本中普遍存在，如3-oxo-NorCA和12-oxo-isoCA，濃度范圍為0.1至5 mM，在所有脊椎動物哺乳類中均檢測到。某些膽汁酸如3-oxoα-MCA和3-oxoβ-MCA則特異性存在于嚙齒類動物中。研究結(jié)果表明，每種哺乳動物物種都有獨特的BA指紋景觀。
3.膽汁酸可拮抗人類雄激素受體
為了進一步鑒定以前未知的BA介導(dǎo)的宿主信號通路和生物學，研究通過細胞基礎(chǔ)的熒光素酶報告基因檢測，篩選了56種未充分表征的BAs，并發(fā)現(xiàn)其中3-oxo-D5-LCA是一種有效的hAR拮抗劑，IC50值為119.4 nM（或443 nM，使用15 pM二氫睪酮[DHT]作為激動劑）。此外，其他幾種已知BAs如3-oxo-D4-LCA和3-oxo-D4,6-LCA也表現(xiàn)出顯著的AR拮抗活性，IC50值分別為133.6 nM和99.7 nM（同樣以15 pM DHT作為激動劑）。這些BA通過平面化的A/B環(huán)與AR配體結(jié)合域（AR-LBD）中的Trp741相互作用，并通過C3羰基和C24羧基形成氫鍵，進一步穩(wěn)定結(jié)合。分子對接實驗支持了這一觀察結(jié)果。更重要的是，這些BA不僅抑制AR依賴基因（如PSA、KLK2和TMPRSS2）的表達，還在LNCaP和C4-2前列腺癌細胞系中有效抑制了細胞增殖，其效果可與臨床使用的AR拮抗劑enzalutamide媲美。此外，這些BA還能夠抑制DHT誘導(dǎo)的AR核轉(zhuǎn)位，表明其拮抗活性部分源于阻止AR進入細胞核。
4.拮抗雄激素受體的膽汁酸來源于微生物群，與人類相關(guān)
本研究通過多方面證據(jù)證實，拮抗雄激素受體（AR）的膽汁酸（BAs）由腸道微生物群依賴性途徑生成，并在人體中具有生理相關(guān)性。首先，多種人類腸道共生菌（如Parabacteroidessp.D13和C.mitsuokai）在體外能夠高效生成這些BA代謝物，且在定植于無菌小鼠模型中時也能產(chǎn)生顯著水平的3-oxo-D4-LCA。其次，宏基因組分析顯示，參與合成這些AR拮抗性BAs的關(guān)鍵基因（如5β-還原酶和3α/3β-HSDH基因）在健康人群中廣泛存在，盡管其相對豐度在不同個體間存在顯著差異。最后，代謝組學分析表明，這些BAs在人體糞便中的濃度范圍可達0–925μM，在血清中也可達0–250 nM，顯示出其在人體內(nèi)的普遍存在性和濃度變異性。這些結(jié)果共同支持了腸道微生物在調(diào)節(jié)宿主激素信號通路中的關(guān)鍵作用。
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