3討論與結(jié)論
中草藥富含生物堿、有機(jī)酸、苷類等多種活性物質(zhì)，不僅具有抗菌、抗病毒作用，還能改善動(dòng)物的生長(zhǎng)、免疫性能，已被廣泛用于水產(chǎn)動(dòng)物疾病的防治中。Chang等和Chen等的研究發(fā)現(xiàn)，飼喂凡納濱對(duì)蝦含100 mg/kg甘草提取物或含0.6%甘草酸苷的飼料，可提高對(duì)蝦酚氧化酶、超氧化物歧化酶等活力，降低對(duì)蝦在溶藻弧菌(V.alginolyticus)攻毒后的死亡率。Zhai等用主要成分為板藍(lán)葉、大黃、黃柏等的三黃散，以500 mg/kg的劑量飼喂感染副溶血弧菌的凡納濱對(duì)蝦，用藥后對(duì)蝦血清免疫參數(shù)和存活率顯著提高。羅新等測(cè)定了42種中草藥對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物常見(jiàn)病原嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)冰片、烏梅、五倍子、訶子、石榴皮、艾葉和黃連7種中草藥水提液具有抑菌活性，其中以冰片的抑菌作用最強(qiáng)，抑菌圈達(dá)到(26.1±1.5)mm。
GD是甘草、板藍(lán)根、人工牛黃、冰片等為主要成分的藥物。程安達(dá)等研究發(fā)現(xiàn)，使用2 mL/kg GD的飼料可改善副溶血弧菌感染引起的對(duì)蝦肝胰腺損傷，降低患病對(duì)蝦的死亡率。在本研究中，GD對(duì)副溶血弧菌CICC 21617的MIC值和MBC值分別為7.6 mg/mL和15.2 mg/mL，1/4MIC以上濃度的GD能明顯抑制副溶血弧菌的生長(zhǎng)，表明該藥物對(duì)副溶血弧菌具有較好的體外抑菌活性，可有效抑制細(xì)菌的增殖。
植物源藥物可通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，干擾其物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、生物合成等功能，從而發(fā)揮抑菌作用。孫揚(yáng)等研究發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌經(jīng)120μg/mL的檸檬草精油處理后，菌體細(xì)胞壁、膜構(gòu)造被破壞，細(xì)胞內(nèi)容物流失，上清液中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性、蛋白質(zhì)含量和電導(dǎo)率上升。Sun等的研究結(jié)果表明，25 mg/mL的藍(lán)莓提取物可破壞副溶血弧菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)胞膜相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響其物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能。
Xin等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)2μL/mL的茴香醛處理，破壞了副溶血弧菌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，影響了其生物膜形成、鞭毛移動(dòng)和群體感應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)GD處理后副溶血弧菌細(xì)胞發(fā)生裂解，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜出現(xiàn)消融，大量胞內(nèi)泄露物質(zhì)漏出，表明GD處理破壞了副溶血弧菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而影響了細(xì)胞膜的通透性，這與以上研究結(jié)論一致。板藍(lán)根和甘草是GD的主要成分，0.25 g/mL的板藍(lán)根微粉水提物能破壞大腸桿菌(Escherichia coli)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性。甘草的主要活性成分光甘草酚，它通過(guò)與細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖結(jié)合來(lái)破壞金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由此推測(cè)它們可能是GD導(dǎo)致副溶血弧菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜損傷的重要活性物質(zhì)。
藥物處理通過(guò)調(diào)控細(xì)菌轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，進(jìn)而影響其生理功能?，F(xiàn)有研究表明，64μg/mL單寧酸處理可改變嗜水氣單胞菌的轉(zhuǎn)錄組；75 mg/mL的原兒茶醛或2μL/mL的茴香醛處理可改變副溶血弧菌的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。它們主要通過(guò)抑制細(xì)菌能量代謝、生物膜形成、黏附、運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)，從而降低其致病力。與這些研究結(jié)論相似，GD處理后副溶血弧菌的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)顯著變化，造成肌苷酸和核糖核苷合成代謝、檸檬酸循環(huán)等相關(guān)基因表達(dá)的顯著下調(diào)。
細(xì)菌的肌苷酸和核糖核苷是細(xì)胞內(nèi)重要的核苷酸，它們?cè)诩?xì)胞生長(zhǎng)、代謝和遺傳信息的傳遞中扮演著關(guān)鍵角色。檸檬酸循環(huán)是細(xì)菌細(xì)胞糖類、脂類、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要代謝途徑，對(duì)于細(xì)胞的能量產(chǎn)生、代謝調(diào)控以及生物合成都具有至關(guān)重要的作用。GD處理后副溶血弧菌的肌苷酸、核糖核苷合成代謝以及檸檬酸循環(huán)的轉(zhuǎn)錄水平下降，表明細(xì)菌的遺傳物質(zhì)合成、能量代謝活動(dòng)可能受到抑制，進(jìn)而影響其生長(zhǎng)、繁殖和致病能力。本研究還發(fā)現(xiàn)，GD處理后副溶血弧菌的群體感應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào)。群體感應(yīng)是副溶血弧菌菌群間的重要通訊機(jī)制，參與調(diào)控耐熱直接溶血毒素基因(tdh)等毒力基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)生物被膜的形成，影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性，從而增強(qiáng)副溶血弧菌的致病力和在環(huán)境中的生存能力，因此GD可能通過(guò)群體感應(yīng)淬滅作用影響副溶血弧菌的致病力。
在本研究中，GD主要促進(jìn)了副溶血弧菌轉(zhuǎn)錄因子活性、細(xì)胞壁合成代謝等相關(guān)基因的表達(dá)。在低濃度藥物的作用下，細(xì)菌為適應(yīng)環(huán)境壓力并維持其生存，可能會(huì)提高或降低特定基因的轉(zhuǎn)錄活性，以減少藥物對(duì)菌體細(xì)胞的滲透和損傷。例如，F(xiàn)eng等的研究發(fā)現(xiàn)，大蒜提取物二烯丙基硫醚可促進(jìn)阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii)細(xì)胞壁合成相關(guān)基因的表達(dá)。馬強(qiáng)等研究表明，在低濃度的β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用下，金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的厚度明顯增加，并促進(jìn)了細(xì)胞壁相關(guān)基因glmU、pbpB、altR、murG的表達(dá)。與這些研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)GD處理主要提高了肽聚糖、氨基聚糖等細(xì)胞壁合成代謝相關(guān)基因的表達(dá)。肽聚糖和氨基聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分之一，它通過(guò)形成堅(jiān)固的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，為細(xì)菌提供機(jī)械支撐，可抵御外界的機(jī)械和滲透損傷。GD處理提高了副溶血弧菌細(xì)胞壁合成代謝的轉(zhuǎn)錄水平，表明菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞后，可能加強(qiáng)了細(xì)胞修復(fù)功能的調(diào)控，以應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的壓力。后續(xù)應(yīng)將組學(xué)分析與RNA干擾、基因敲除等分子生物學(xué)方法相結(jié)合，進(jìn)一步厘清GD抑殺副溶血弧菌的關(guān)鍵基因及代謝通路。
綜上所述，本研究結(jié)果表明GD可抑制副溶血弧菌生長(zhǎng)，破壞其細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。在轉(zhuǎn)錄水平上，GD主要抑制了副溶血弧菌的肌苷酸、核糖核苷合成代謝以及檸檬酸循環(huán)等能量代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)菌體可能也啟動(dòng)了細(xì)胞壁損傷的自我修復(fù)機(jī)制。本研究初步探明了GD對(duì)副溶血弧菌抑制活性及作用機(jī)制，可為增加GD的靶動(dòng)物提供背景參考資料，也為新型弧菌防控藥物的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
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