1材料與方法
1.1試劑
2216E肉湯、瓊脂培養(yǎng)基均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；刃天青購自上海源葉生物科技有限公司；細(xì)菌RNA提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit、通用熒光定量PCR試劑盒TB Green®Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)、ROX plus等RT-qPCR相關(guān)試劑均購自TaKaRa公司；板藍(lán)根、人工牛黃、甘草、冰片、豬膽粉、玄明粉均購自云南保和堂中醫(yī)藥有限公司；乙醇、丙二醇、碳酸氫鈉均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2甘膽口服液的制備
參照江厚生等方法制備甘膽口服液(GD)，稱取板藍(lán)根100 g、甘草40 g、玄明粉30 g，加1 400 mL水煎煮3次，將3次煎液合并濾過，濾液濃縮至相對密度為1.15-1.20(50℃)，放冷后加入500 mL乙醇，過濾并回收乙醇，加水約250 mL，靜置備用。稱取豬膽粉20 g、人工牛黃34 g、冰片20 g，加入乙醇100 mL使其溶解，加入上述提取液，加水至1 000 mL，攪勻?yàn)V過后即得GD，每毫升藥液約含有0.244 g原生藥，即濃度約為244 mg/mL。
1.3菌株培養(yǎng)
副溶血弧菌CICC 21617購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，經(jīng)鑒定該菌符合副溶血弧菌的生理生化特性，多次傳代后仍具有溶血性，攜帶PirA毒力基因，且對蝦類有致病性。在副溶血弧菌CICC 21617菌液中加入終濃度為20%的甘油，保存于-80℃超低溫冰箱。在無菌條件下將副溶血弧菌劃線接種于2216E瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于2216E肉湯培養(yǎng)基，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，通過比濁法測定副溶血弧菌菌液濃度。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，用2216E肉湯培養(yǎng)基將菌液調(diào)至所需濃度。
1.4最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)測定
采用刃天青顯色法測定GD對副溶血弧菌CICC 21617的MIC，在無菌超凈臺(tái)中取一塊無菌的96孔板，在第一列各孔中加入100μL 244 mg/mL的GD，逐列用2216E肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行2倍梯度稀釋，使藥物終濃度分別為122、61、30.5、15.2、7.6、3.8、1.9、0.96、0.48和0.24 mg/mL，另設(shè)置1列作陽性對照(加入100μL 1×105 CFU/mL的副溶血弧菌菌液)和1列陰性對照(加入100μL 2216E肉湯培養(yǎng)基)，最后在各濃度藥物組和陽性對照組的孔中添加100μL 1×105 CFU/mL的副溶血弧菌菌液，陰性對照加等量的2216E肉湯培養(yǎng)基。將96孔板放入28℃恒溫培養(yǎng)箱，24 h后加入50μL藍(lán)色刃天青溶液，12 h后觀察培養(yǎng)液顏色變化，若培養(yǎng)液保持藍(lán)色表明細(xì)菌生長受抑制，培養(yǎng)液變粉色說明有細(xì)菌生長，將抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度作為MIC。吸取MIC濃度以上菌液各100μL，分別涂布于2216E瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)24 h，觀察是否有菌落長出，將無菌生長的最低藥物濃度作為MBC。
1.5生長曲線測定
將副溶血弧菌CICC 21617接入2216E肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，并用培養(yǎng)基將菌液濃度調(diào)整為1×107 CFU/mL，按照體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接入含6 mL滅菌2216E肉湯培養(yǎng)基的無菌試管(規(guī)格為10 mL)，即得初始菌液濃度為1×105 CFU/mL。上述試管分別加入不同濃度的GD藥液，使其終濃度分別為MIC、1/2MIC和1/4MIC，同時(shí)設(shè)置空白對照組(添加等量PBS溶液)，每組3個(gè)重復(fù)。將試管放入全自動(dòng)微生物生長曲線分析儀，在28℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)32 h，確保達(dá)到細(xì)菌的穩(wěn)定生長期，其間每2 h測定菌液OD600值，繪制細(xì)菌生長曲線。
1.6掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)觀察
將副溶血弧菌CICC 21617培養(yǎng)12 h至對數(shù)生長期(OD600值為0.6-0.8)，用培養(yǎng)基將菌液濃度調(diào)整至1×105 CFU/mL，加入終濃度為1/4MIC的GD，另設(shè)置對照組(添加等量PBS溶液)，28℃靜置6 h，取1 mL菌液，在4℃、4 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液，用PBS清洗菌體沉淀，加入2.5%戊二醛，放入4℃冰箱過夜。用不同濃度乙醇(30%、50%、70%、90%和100%)對樣品進(jìn)行連續(xù)梯度脫水，采用干燥儀干燥樣品，噴金制樣，通過掃描電子顯微鏡(HITACHI公司)和透射電子顯微鏡(HITACHI公司)觀察菌體表面及內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)。
1.7轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及細(xì)菌RNA提取
基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析GD對副溶血弧菌CICC 21617轉(zhuǎn)錄水平的影響。收集超過0.1 g的菌體，依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定初始菌液濃度為1×108 CFU/mL，GD藥物濃度為1/4MIC。實(shí)驗(yàn)組(GD)副溶血弧菌菌液中添加1/4MIC濃度的GD，對照組(CK)添加等量PBS，每組3個(gè)重復(fù)。將兩組菌液置于28℃、150 r/min條件下處理6 h，參照翟立公等方法提取菌液總RNA，使用Agilent 2100生物分析儀測定提取的RNA質(zhì)量，采用NanoDrop 2000(ThermoFisher Scientific公司)超微量分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，將符合質(zhì)量要求(OD260/OD280為1.8-2.0，OD260/OD230大于2.0，總質(zhì)量大于2μg)的樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.8 cDNA文庫構(gòu)建及測序數(shù)據(jù)質(zhì)控
利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后對cDNA進(jìn)行純化和濃縮，再依次進(jìn)行末端修復(fù)、加堿基A、加測序接頭處理、PCR純化和富集等操作，從而構(gòu)建出最終的cDNA文庫，然后用NovaSeq X Plus平臺(tái)進(jìn)行測序。對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控處理，去除包含adapter序列的reads、剔除測序質(zhì)量值低于Q20的序列等。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對所測得的reads進(jìn)行堿基質(zhì)量、堿基錯(cuò)誤率等分析，采用Bowtie2將測序序列與副溶血弧菌參考基因組(GenBank登錄號為gca_000196095.1)進(jìn)行比對，獲得基因的功能信息。
1.9差異表達(dá)基因及功能分析
采用韋恩圖分析GD處理組和對照組的共享及特有基因；運(yùn)用主成分分析(principal component analysis,PCA)表征不同組別樣品轉(zhuǎn)錄組的總體差異；利用R語言的heatmap軟件包繪制熱圖，對各組樣品進(jìn)行聚類分析。使用DESeq2篩選出各組間差異表達(dá)基因(|log2 fold change|>1，P<0.05)，并通過表達(dá)量差異散點(diǎn)圖可視化顯著上調(diào)和下調(diào)的基因數(shù)量及其分布。基于Fisher精確檢驗(yàn)方法，利用goatools軟件對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，采用KOBAS軟件對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號通路的富集分析，當(dāng)經(jīng)過校正的P值(Padjust)<0.05時(shí)，認(rèn)為此GO功能或KEGG信號通路被顯著富集。
1.10逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)驗(yàn)證
為驗(yàn)證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取顯著上調(diào)和下調(diào)基因各6個(gè)，進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證試驗(yàn)。將這些待驗(yàn)證的基因序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，使用Primer-BLAST功能設(shè)計(jì)目的基因引物(表1)，并由浙江尚亞生物技術(shù)有限公司合成。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，以16S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因，進(jìn)行RT-qPCR試驗(yàn)。反應(yīng)體系(10μL)：SYBR Mix 5μL，上、下游引物(10μmol/mL)各0.4μL，cDNA模板1μL，ddH2O 3.2μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。采用熔解曲線分析產(chǎn)物特異性。
表1 RT-qPCR所用引物
1.11數(shù)據(jù)處理及分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS v27.0.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(one way ANOVA)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(independent t-test)檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)的差異，表示P<0.05，表示P<0.01。文中圖表用Origin 2022或Microsoft Visio 2023繪制。
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