[摘要]目的探討膀胱癌微環(huán)境中M2巨噬細胞通過CLDN10信號通路對膀胱癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的調(diào)控作用及其機制。方法收集2020年3-9月重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的10例膀胱癌患者的新鮮癌組織及癌旁組織標(biāo)本，免疫組化觀測巨噬細胞表面標(biāo)志物在膀胱癌組織中的表達；對癌和癌旁組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出受巨噬細胞調(diào)控的潛在基因。采用CCK-8、細胞克隆、Western blot等方法觀測CLDN10對膀胱癌細胞生長和增殖的作用。結(jié)果巨噬細胞特征性分子CD68和M2型巨噬細胞CD163分子在膀胱癌組織中表達增加。對基因測序結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn)CLDN10基因在膀胱癌組織中表達最顯著，對膀胱癌組織免疫組化結(jié)果行免疫評分后發(fā)現(xiàn)CLDN10的表達與巨噬細胞在膀胱癌組織中的浸潤呈正相關(guān)。Western blot檢測結(jié)果表明膀胱癌組織中CLDN10蛋白的表達水平較癌旁組織高(P<0.05)。敲低CLDN10的表達后，與對照組相比，生長曲線結(jié)果表明膀胱癌細胞生長能力下降，細胞克隆形成實驗結(jié)果表明膀胱癌細胞形成細胞克隆數(shù)目降低(198.0±10.3 vs 145.0±8.4，P<0.05)，Western blot檢測結(jié)果表明EMT相關(guān)指標(biāo)蛋白snail、twist、vimentin的表達水平降低，而E-cadherin的表達水平升高(P<0.05)。結(jié)論巨噬細胞上調(diào)膀胱癌細胞CLDN10的表達促進膀胱癌細胞EMT的發(fā)生。
腫瘤微環(huán)境(tumor micro-environment，TME)是指腫瘤細胞所在的內(nèi)外環(huán)境，包括腫瘤所在組織的結(jié)構(gòu)、功能和代謝，與腫瘤的發(fā)生、生長及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境中浸潤的各種免疫細胞和細胞因子構(gòu)成了腫瘤的免疫微環(huán)境，主要包括巨噬細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、Treg細胞等。這些細胞具有促癌和抑癌的雙重調(diào)節(jié)作用，而這種調(diào)節(jié)作用主要取決于免疫細胞的功能狀態(tài)和類別。如何提高TME中免疫浸潤細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷作用，是近年來腫瘤研究領(lǐng)域的前沿?zé)狳c之一。例如，免疫檢查點抑制劑PD-1/PD-L1單克隆抗體通過增強CD8+T細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷作用，獲得了顯著的臨床療效。近年來，隨著對腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的研究越來越深入，人們意識到免疫細胞的調(diào)控功能越來越重要和復(fù)雜。
膀胱癌是中國人群泌尿系統(tǒng)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，根據(jù)2016年CHEN等發(fā)布的2015中國癌癥發(fā)病情況，膀胱癌的發(fā)生率和死亡率正逐年升高。特別是晚期膀胱癌患者，傳統(tǒng)放、化療治療效果較差，而以PD-1/PD-L1單抗為代表的新型免疫治療的問世無疑給晚期膀胱癌患者帶來了新的希望。盡管如此，目前的免疫治療方案仍面臨有效率不高、療效不確切等諸多問題。要解決這些問題，首先要深入研究膀胱癌瘤微環(huán)境中免疫細胞的種類分布及其調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制。因此，本研究探討膀胱癌微環(huán)境中免疫細胞的分布情況，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞在膀胱癌組織中浸潤數(shù)量明顯增多；進一步采用內(nèi)部測序數(shù)據(jù)篩選出受巨噬細胞調(diào)控的潛在靶基因，并用外部測序數(shù)據(jù)進行了驗證，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞可能通過CLDN10基因介導(dǎo)的信號通路對膀胱癌細胞進行調(diào)控。
1資料與方法
1.1標(biāo)本來源
收集2020年3-9月重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行根治性膀胱全切的10例膀胱癌患者癌組織和癌旁組織新鮮標(biāo)本，保存于福爾馬林標(biāo)本保存液或液氮中，分別用于免疫組化實驗和Western blot實驗。其中，男性8例，女性2例；年齡47~72歲，平均61.8歲。根據(jù)2010AJCC TNM分期，T1期1例，T2期8例，T3期1例；所有癌組織標(biāo)本經(jīng)病理診斷為尿路上皮癌。本研究經(jīng)重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2021年2月)。
1.2膀胱癌細胞系
膀胱癌T24細胞株來源于中山大學(xué)腫瘤防治中心實驗研究部的基礎(chǔ)實驗室。細胞在含10%小牛血清、100 IU/mL青/鏈霉素的RPMI1640的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為：37℃、5%CO2的濕化培養(yǎng)箱中。
1.3免疫組化檢測
將福爾馬林液固定過的膀胱癌組織標(biāo)本用石蠟包埋后切片，經(jīng)過脫蠟、抗原修復(fù)、抗體孵育、DAB染色、封片等過程后，在顯微鏡下觀察染色情況。對樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選癌組織和癌旁組織差異表達基因；依據(jù)膀胱癌組織中巨噬細胞的表達強弱進行免疫評分，分為高低浸潤組，采用軟件分析技術(shù)篩選出兩組間的差異表達基因。
1.4 Western blot檢測
將液氮中保存的膀胱癌組織標(biāo)本在液氮環(huán)境下研磨后加入RIPA細胞裂解液，并離心后分離提取出蛋白上清液。然后通過配制SDS電泳凝膠、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育等步驟后，用CLDN10、Snail、Twist、E-cadherin、β-actin、GAPDH等抗體檢測相應(yīng)蛋白的表達。
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