3討論與結(jié)論
昆蟲病原線蟲進(jìn)入昆蟲體內(nèi)后，將其攜帶的共生細(xì)菌釋放于寄主昆蟲的血淋巴中，共生細(xì)菌迅速繁殖產(chǎn)生殺蟲毒素，昆蟲病原線蟲自身分泌的毒素結(jié)合共生細(xì)菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)分解寄主昆蟲組織，使寄主昆蟲在短時(shí)間內(nèi)患敗血癥死亡(王大業(yè)，2020)。目前已經(jīng)有對(duì)昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌的殺蟲蛋白和共生菌代謝產(chǎn)物開發(fā)的研究，結(jié)果表明，共生細(xì)菌具有殺蟲活性主要是其代謝產(chǎn)物中的血腔活性物質(zhì)起作用(彭劉亮，2017)，包括抑菌活性物質(zhì)(黃武仁等，2005;Fangetal.，2011;Binda-Rossettietal.，2016)、殺蟲毒素(Bowenetal.，1998;Sheetsetal.，2011;Yangetal.，2012)、抗癌活性物質(zhì)(Paiketal.，2001)等，在目前的相關(guān)研究中，昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌常被用作生物制劑應(yīng)用于害蟲生物防治及生態(tài)環(huán)保領(lǐng)域。
本研究結(jié)果表明，共生細(xì)菌作為昆蟲病原線蟲在寄主昆蟲體內(nèi)生長(zhǎng)繁殖的重要介體，其生長(zhǎng)發(fā)育可以受胰島素的調(diào)控，共生細(xì)菌可以直接吸收利用胰島素。本研究結(jié)果將在利用昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物提高對(duì)害蟲的致病力方面提供新思路(吳文丹等，2014;王杰等，2021)，而對(duì)于共生細(xì)菌的具體殺蟲機(jī)制以及能否利用胰島素提高共生細(xì)菌代謝產(chǎn)物活性，尤其是血腔活性物質(zhì)的活性，進(jìn)而改善昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌的殺蟲效果等問題還尚不明確，這也將成為未來新的研究方向。
本研究結(jié)果表明，一定濃度胰島素處理會(huì)促進(jìn)共生細(xì)菌伯氏致病桿菌0657L菌落的生長(zhǎng)(圖1，2)，不同濃度的胰島素對(duì)伯氏致病桿菌0657L生長(zhǎng)速率的提高程度不同，低濃度胰島素(1∶5 000)較高濃度胰島素處理(1∶500)生長(zhǎng)快(圖3)。
而有趣的是，高濃度胰島素(1∶500)處理的伯氏致病桿菌0657L飼喂的卡森斯氏線蟲0657L運(yùn)動(dòng)和吞咽能力均強(qiáng)于低濃度胰島素(1∶5 000)處理的伯氏致病桿菌0657L飼喂的卡森斯氏線蟲0657L(圖5，6)。在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)上表現(xiàn)為促進(jìn)共生細(xì)菌生長(zhǎng)速率加快的最佳濃度為1∶5 000，而促進(jìn)線蟲行為學(xué)能力增強(qiáng)的最佳濃度是1∶500。這表明，胰島素對(duì)卡森斯氏線蟲0657L生長(zhǎng)發(fā)育及其體內(nèi)分離出的共生細(xì)菌伯氏致病桿菌0657L的生長(zhǎng)都有影響，但可能因?yàn)榧?xì)菌和線蟲的生長(zhǎng)繁殖方式不同，對(duì)胰島素的吸收和利用的方式也不同，因此共生細(xì)菌在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出低濃度胰島素處理下直徑更大，而被取食后，仍然為高濃度更有利于線蟲抵抗運(yùn)動(dòng)和吞咽能力衰退，這就與營(yíng)養(yǎng)成分利用有關(guān)，具體機(jī)理還有待進(jìn)一步考究。
胰島素作為一種內(nèi)分泌激素，與細(xì)胞生長(zhǎng)、壽命、營(yíng)養(yǎng)、生殖有關(guān)，還可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及脂肪儲(chǔ)存，防止脂肪分解等。胰島素在機(jī)體中的功能表現(xiàn)在多個(gè)方面，涉及受體結(jié)合，信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)和缺陷的糾正等，進(jìn)食和禁食期間能量的儲(chǔ)存和釋放，基本由胰島素調(diào)控，是生物體生存的重要方面(Mayeretal.，2007;顧世紅和陳建國(guó)，2009;Thevisetal.，2010)。胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin growth factor，IGF)和胰島素樣肽(insulin-like peptide，ILP)通常與維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)有關(guān)，當(dāng)機(jī)體內(nèi)胰島素分泌不足時(shí)，來自食物的糖分就只流動(dòng)在血液中，無法進(jìn)入細(xì)胞為機(jī)體所用，此時(shí)胰島素的補(bǔ)充能夠幫助食物中的糖分順利進(jìn)入機(jī)體內(nèi)各組織細(xì)胞以提供能量(顧世紅和陳建國(guó)，2009)，這種功能在昆蟲(果蠅)和秀麗隱桿線蟲中是保守的(Thevisetal.，2010;Graham and Pick，2017)，此外，胰島素在代謝、生長(zhǎng)、繁殖、成蟲健康和衰老方面也發(fā)揮著重要作用(Hafen，2004)。胰島素信號(hào)通路是高度保守的衰老調(diào)控通路，包括Ins R/IRS-1通路和RAS/MAPK通路(Beale，2013)。其中IRS-1可通過PI3K/Akt通路起到促進(jìn)胰島素影響葡萄糖代謝與脂質(zhì)代謝的作用，該通路中胰島素受體同源蛋白daf-16受基因daf-2負(fù)調(diào)控(張思雨等，2022)。本研究發(fā)現(xiàn)，胰島素處理在明顯促進(jìn)卡森斯氏線蟲0657L共生細(xì)菌的生長(zhǎng)的同時(shí)，有延長(zhǎng)昆蟲病原線蟲壽命、抵御運(yùn)動(dòng)和吞咽能力衰退作用。這可以說明昆蟲病原線蟲作為共生細(xì)菌的攜帶者，能夠通過胰島素處理的特異性共生細(xì)菌間接地影響昆蟲病原線蟲體內(nèi)新陳代謝信號(hào)的傳導(dǎo)(共生細(xì)菌吸收胰島素后長(zhǎng)勢(shì)更佳，為昆蟲病原線蟲提供穩(wěn)定的生活環(huán)境和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)、脂類及少量糖類參與其體內(nèi)細(xì)胞膜的組成，細(xì)胞膜完整保證了細(xì)胞的正常能量和物質(zhì)交流)，從而起到抗衰老的作用，初步揭示了胰島素在昆蟲病原線蟲及其共生細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。
研究表明，壽命的延長(zhǎng)通常是與飲食限制(dietary restriction，DR)和熱量限制(caloric restriction，CR)有關(guān)的，且飲食限制誘導(dǎo)的壽命延長(zhǎng)的其中一個(gè)關(guān)鍵通路是IIS(胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子1)信號(hào)傳導(dǎo)(N?ssel and Vanden，2016)。在本研究中，吞咽試驗(yàn)為直接在線蟲生長(zhǎng)培養(yǎng)基上統(tǒng)計(jì)中食道球抽動(dòng)次數(shù)，即線蟲正常取食，說明并未造成飲食限制(即饑餓)，而已有報(bào)道線蟲(秀麗隱桿線蟲)可在多種不同飲食限制方案下主要通過激活LET-363/mTOR和IIS兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)物傳感途徑延長(zhǎng)壽命(Greer and Brunet，2009)，結(jié)合上述證據(jù)，可推斷胰島素能夠延長(zhǎng)昆蟲病原線蟲的壽命，且排除胰島素對(duì)卡森斯氏線蟲0657L壽命的延長(zhǎng)作用是由飲食限制引起的可能性，這與人類醫(yī)學(xué)模式生物秀麗隱桿線蟲C.elegans的壽命研究結(jié)果并不完全吻合。鑒于本研究中線蟲攝食正常但最終得到壽命延長(zhǎng)的結(jié)論，初步猜想是某些酶通過IIS通路中的靶標(biāo)基因(如UTX-1)調(diào)控壽命(Greer and Brunet，2009)，共生細(xì)菌吸收胰島素后為卡森斯氏線蟲0657L提供豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，線蟲充分利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)至體內(nèi)蛋白(酶)合成達(dá)到平衡時(shí)，相應(yīng)靶標(biāo)基因所在的信號(hào)通路關(guān)閉，基因表達(dá)量降低，衰老相關(guān)細(xì)胞功能維持穩(wěn)態(tài)，壽命得以延長(zhǎng)。這也恰好說明，壽命不僅在遺傳水平上被調(diào)控，而且與新陳代謝調(diào)節(jié)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也密切相關(guān)。
研究使用胰島素處理的共生細(xì)菌培養(yǎng)卡森斯氏線蟲0657L，發(fā)現(xiàn)線蟲生長(zhǎng)早期，頭部擺動(dòng)次數(shù)和吞咽次數(shù)均較慢，生命中期，其頭部擺動(dòng)頻率和咽泵吞咽頻率均提高，直到生命后期又有一定程度的下降，說明線蟲的衰老隨著生命過程而發(fā)生，主要體現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)和吞咽能力上。運(yùn)動(dòng)和吞咽與肌肉功能息息相關(guān)(Dall and F?rgeman，2019;劉嘉榆，2022)，3個(gè)不同生長(zhǎng)階段中的胰島素處理組運(yùn)動(dòng)和吞咽能力均較對(duì)照組強(qiáng)，表明胰島素可以提高線蟲的肌肉功能，起到有效抵抗衰老的作用。
綜上所述，胰島素的補(bǔ)充可以促進(jìn)昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌的生長(zhǎng)，能夠延長(zhǎng)昆蟲病原線蟲的平均壽命并提高運(yùn)動(dòng)和吞咽能力。本研究?jī)H證實(shí)了胰島素在線蟲生物學(xué)特征方面的作用，為昆蟲病原線蟲的制劑化提供了新的思路，也為昆蟲病原線蟲在生物防治領(lǐng)域的進(jìn)一步高效開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。為明確其作為調(diào)控機(jī)體代謝的重要物質(zhì)在表觀遺傳學(xué)上是否也具有類似的作用，具體的作用機(jī)制如何，還需通過分子生物學(xué)技術(shù)手段的進(jìn)一步探究。
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