1材料與方法
1.1試驗(yàn)動(dòng)物及其神經(jīng)類型分組
本試驗(yàn)依據(jù)現(xiàn)有工作犬神經(jīng)類型的行為學(xué)研究，并根據(jù)在實(shí)戰(zhàn)中執(zhí)行任務(wù)的特征需求制定工作犬神經(jīng)類型評估標(biāo)準(zhǔn)(表1)。依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，從公安部沈陽警犬基地90頭警用馬里努阿犬中選取14頭典型的安靜型與活潑型犬(體重為25.62kg±2.23kg)，每種類型7頭(公犬4頭，母犬3頭)，所有試驗(yàn)犬健康、年齡相近(12月齡)。
表1工作犬神經(jīng)類型評估標(biāo)準(zhǔn)
1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧
采用配對試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將14頭馬里努阿犬按照配對要求(性別相同、體重接近)配成7對。試驗(yàn)飼糧為普瑞納飼料有限公司生產(chǎn)的全價(jià)配合飼糧(粗蛋白質(zhì)含量為27%)，其營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)滿足NRC(2006)犬營養(yǎng)需要量。試驗(yàn)周期為30d，其中1~7d為環(huán)境適應(yīng)期，8~30d為正式試驗(yàn)期。
1.3飼養(yǎng)管理及樣品采集
所有試驗(yàn)犬均按照警用工作犬飼養(yǎng)管理規(guī)范進(jìn)行統(tǒng)一的飼養(yǎng)管理，采用單籠飼養(yǎng)，并在試驗(yàn)開始前對試驗(yàn)犬按標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行防疫并驅(qū)蟲。每日08:30及16:30分2次飼喂(600g/d)，期間自由飲水。每次進(jìn)食結(jié)束40min后進(jìn)行自由活動(dòng)，每次自由活動(dòng)時(shí)間不少于60min。試驗(yàn)期間定期對試驗(yàn)場所進(jìn)行沖洗、消毒。試驗(yàn)第30天，分別收集試驗(yàn)犬2次飼喂后首次排出的新鮮糞便10g，每頭試驗(yàn)犬的兩個(gè)糞便樣品混合均勻后置于EP管中，于-80℃待測。
1.4指標(biāo)測定與方法
采用QiagenDNA提取試劑盒提取試驗(yàn)犬糞便總DNA，提取步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。對提取的總DNA進(jìn)行純化、檢測濃度和純度。以提取的糞便總DNA為模板，對細(xì)菌V3~V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用上游引物為341F(5'-CCTACGGG?NGGCWGCAG-3')，下游引物為805R(5'-GACT?ACHVGGGTATCTAATCC-3')。PCR擴(kuò)增體系20μL:5×FastPfuBuffer4μL，2.5mmol/LdNTPs2μL，5μmol/L上、下游引物各1.0μL，F(xiàn)astPfuPolymerase0.4μL，DNA模板10ng，補(bǔ)ddH2O至20μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3min;95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共27個(gè)循環(huán);72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測、切膠回收后，進(jìn)行高通量測序。對測得的序列，使用USEARCH(11.0.667)在相似閾值大于97%的情況下將符合條件的序列分配到相同操作分類單元(OTU);基于QIIME2軟件，使用SILVA數(shù)據(jù)庫(138.1)對OTU進(jìn)行分類物種注釋;使用Mothur(1.45.3)對各樣本物種進(jìn)行Alpha多樣性分析;采用主坐標(biāo)分析方法(PCoA)對各樣本物種復(fù)雜性進(jìn)行Beta多樣性分析;使用R(4.4.0)中microeco包(1.8.0)進(jìn)行LEfSe分析，設(shè)置LDA閾值為2.5(lg);使用R(4.4.0)中psych包(2.4.6)進(jìn)行相關(guān)性分析。
1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS9.4的MEANS模塊對基本統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行分析，采用Paired-SampleT Test對不同處理犬的糞便微生物指標(biāo)和血液生化指標(biāo)進(jìn)行差異性分析;基于SPARCC方法統(tǒng)計(jì)14頭犬糞便菌群之間的相關(guān)性(分別在門水平和屬水平上統(tǒng)計(jì))，P小于0.05為差異顯著;P小于0.01為差異極顯著。
使用GraphPadPrism8.0軟件作圖。
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