3討論
陰溝腸桿菌廣泛存在于自然界中，鯔魚經(jīng)感染后會(huì)引起腦脊髓炎并出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，且該菌對(duì)淡水鯊魚具有高致病性，感染后病魚表現(xiàn)為胸鰭、腹鰭、尾鰭及內(nèi)臟出血，并且很快死亡。本文中分離的陰溝腸桿菌來(lái)自福建某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，通過(guò)其在不同培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況可以看出，該菌在高鹽與低鹽環(huán)境下均可生長(zhǎng)，故仍具有感染人與動(dòng)物的風(fēng)險(xiǎn)。其耐藥性較強(qiáng)，對(duì)包括青霉素在內(nèi)的16種抗生素均表現(xiàn)出耐藥性，可能與養(yǎng)殖場(chǎng)長(zhǎng)期使用各種抗生素防治有關(guān)。如今，陰溝腸桿菌的耐藥性日益嚴(yán)重，迫切需要開發(fā)新型抗菌藥物以治療陰溝腸桿菌感染。
噬菌體因其高效的殺菌作用、高特異性和成本低等優(yōu)點(diǎn)，在新型抗菌藥物的應(yīng)用上展現(xiàn)出極強(qiáng)潛力。因此，我們分離并鑒定了一株可以侵染陰溝腸桿菌的烈性噬菌體，并將其命名為ZX14。該噬菌體在雙層瓊脂平板上可形成透亮清晰的噬菌斑，其裂解陰溝腸桿菌2025時(shí)，潛伏期為20 min，裂解量為45 PFU/cell，在pH 5~12時(shí)有較好穩(wěn)定性，在37~50℃時(shí)其活性長(zhǎng)時(shí)間無(wú)明顯變化。因此，若將ZX14用于水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境消毒會(huì)有助于減少對(duì)其敏感的陰溝腸桿菌數(shù)量，降低水產(chǎn)動(dòng)物感染發(fā)生率。宿主譜分析表明ZX14對(duì)陰溝腸桿菌復(fù)合體其中3種細(xì)菌(陰溝腸桿菌、路德維希腸桿菌、神戶腸桿菌)均表現(xiàn)出良好的裂解效果，有望應(yīng)用于陰溝腸桿菌復(fù)合體感染的治療。目前尚未報(bào)道有噬菌體可同時(shí)裂解該三種細(xì)菌，根據(jù)宿主譜、最佳MOI及裂解量等特性，可以考慮將潛伏期或宿主譜與噬菌體ZX14互補(bǔ)且裂解量高的噬菌體與ZX14組成一種有效的噬菌體雞尾酒，用于防控耐藥性陰溝腸桿菌。
噬菌體ZX14的測(cè)序結(jié)果顯示，其基因組全長(zhǎng)173 679 bp，包含294個(gè)ORF，與DNA包裝有關(guān)的ORF所編碼的蛋白質(zhì)包括末端酶大亞基和小亞基，它們?cè)陔p鏈DNA病毒包裝過(guò)程中扮演重要角色。小亞基決定了DNA包裝的特異性，而大亞基與噬菌體結(jié)構(gòu)相關(guān)ORF所編碼的門戶蛋白結(jié)合，形成的五聚體為DNA包裝提供了動(dòng)力，使DNA能裝入衣殼中。與噬菌體裂解有關(guān)的ORF可以編碼裂解酶，裂解酶主要作用于噬菌體侵染后期，通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，使子代噬菌體得以釋放。它是噬菌體繁殖過(guò)程中不可或缺的重要蛋白質(zhì)，幫助噬菌體完成了細(xì)胞裂解和噬菌體釋放。ZX14基因組中還包含了10個(gè)tRNA基因，噬菌體本身攜帶的tRNA能降低噬菌體對(duì)宿主菌tRNA的依賴性，一定程度上能提高噬菌體的裂解能力，從而起到擴(kuò)大裂解譜范圍的作用。通過(guò)檢索CARD與VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)后，未檢測(cè)到抗生素耐藥或毒力基因，說(shuō)明噬菌體在控制陰溝腸桿菌生長(zhǎng)中安全性較好，具有輔助或替代抗生素治療耐藥性陰溝腸桿菌的潛力。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，ZX14與Enterobacter phage vB EclM CIP9、Kosakonia phage 305、Enterobacter phage vB EclM Q7622親緣關(guān)系最近，該4種噬菌體均屬于神奈川病毒屬，故可將ZX14歸屬于神奈川病毒屬新成員。
在獲得基因組序列后，需要通過(guò)多種不同序列比對(duì)方法來(lái)確定其新穎性，NCBI比對(duì)結(jié)果顯示，與ZX14序列相似性最高的噬菌體為Q7622，通過(guò)將BLAST查詢中發(fā)現(xiàn)的覆蓋率乘以相似性來(lái)獲得核苷酸相似性粗略估計(jì)，其覆蓋率為96%，相似率為96.62%，再通過(guò)ANI熱圖分析將ZX14與10種相似噬菌體進(jìn)行核酸相似性比較，分析結(jié)果均低于現(xiàn)行國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)主要物種劃分的95%。根據(jù)核苷酸水平分析及系統(tǒng)發(fā)育分析所產(chǎn)生的差異，可以認(rèn)定噬菌體ZX14為一種新型陰溝腸桿菌噬菌體。
4結(jié)論
本研究成功分離出一種新型陰溝腸桿菌噬菌體，通過(guò)對(duì)其生物學(xué)特性和穩(wěn)定性測(cè)定與分析，證明其具有高效價(jià)、快速增殖及強(qiáng)大穩(wěn)定性等特點(diǎn)。同時(shí)，通過(guò)對(duì)其基因組進(jìn)行比較，確保了噬菌體ZX14的新穎性。因此，該噬菌體具有進(jìn)一步開發(fā)成抗致病性陰溝腸桿菌產(chǎn)品的潛力，為未來(lái)治療超級(jí)細(xì)菌提供了新途徑。
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