實(shí)驗(yàn)采用龍陵黃山羊耳緣組織塊貼壁培養(yǎng)法首次對(duì)龍陵黃山羊成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、冷凍保存建立了龍陵黃山羊耳緣成纖維細(xì)胞系；并對(duì)其細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活率、細(xì)胞核型等生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：細(xì)胞倍增時(shí)間48 h，生長曲線為“S”型；染色體中正常二倍體染色體2n=60所占比例為91.68%。
龍陵黃山羊?yàn)樵颇鲜〉牡胤絻?yōu)良品種，因其被毛黃色且產(chǎn)于龍陵縣而得名。該品種具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼的特點(diǎn)，并以肉質(zhì)細(xì)嫩、味美多汁、膻味小而著稱。龍陵縣地處中緬邊境。龍陵黃山羊是在特殊的地理環(huán)境下，經(jīng)過長期的自然選擇和人工選育形成的。該羊于1987年被列為云南省山羊保種品種之一，目前保種主要采取原產(chǎn)地活體保種的方式，保種方式單一、保種成本高，難以承擔(dān)繁重的保種任務(wù)。而體細(xì)胞建系和冷凍保存技術(shù)是解決云南省地方家畜品種遺傳資源保護(hù)的有力手段，它不但可以長時(shí)間保存優(yōu)良家畜品種遺傳資源，而且結(jié)合其他生物技術(shù)，如體細(xì)胞克隆或轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以加快新品種培育速度，從而提高云南省家畜種質(zhì)資源創(chuàng)新利用的技術(shù)水平。本研究針對(duì)此背景，以龍陵黃山羊這一省級(jí)保護(hù)動(dòng)物的細(xì)胞為研究對(duì)象，利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，從染色體水平、形態(tài)學(xué)水平進(jìn)行了研究，并對(duì)遺傳種質(zhì)資源進(jìn)行了保存。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1實(shí)驗(yàn)材料龍陵黃山羊耳樣采自云南省保山市龍陵縣烏木山良種繁育場(chǎng)，試驗(yàn)用耳樣來源于1月齡龍陵黃山羊耳緣組織。
1.1.2主要試劑、儀器高糖DMEM、胎牛血清（FBS）由Gibco公司生產(chǎn)。青鏈霉素溶液和胰蛋白酶溶液購自Bioind公司；一次性塑料培養(yǎng)皿為Nunclon公司生產(chǎn)。
主要儀器設(shè)備：倒置相差顯微鏡（Olympus，Nikon）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo）；透射電鏡（JEM-1011）；實(shí)體顯微（Olympus）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀；程序降溫盒；液氮罐等。
1.2方法
1.2.1耳緣組織成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)選擇健康的龍陵黃山羊耳緣組織刮凈毛，用碘伏消毒后再用75%的酒精擦拭。用滅過菌的耳號(hào)鉗取耳緣組織樣本，75%酒精浸泡2min，再用生理鹽水+1%青鏈霉素溶液沖洗3次，然后放入高糖DMEM+1%青鏈霉素溶液中，并放入4℃泡沫箱，24 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)。在超凈工作臺(tái)上用柳葉刀刮去皮膚表面污物。用含1%青鏈霉素的PBS溶液沖洗4次，再用手術(shù)剪剪成碎塊，放入直徑50mm的培養(yǎng)皿中，每皿7～8塊，緩慢加入少量培養(yǎng)液。培養(yǎng)液：高糖DMEM+10%FBS+1%青鏈霉素。最后放入培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2，飽和濕度）中培養(yǎng)。每天在倒置相差顯微鏡下觀察、照相、記錄細(xì)胞遷移和增殖情況。
1.2.2成纖維細(xì)胞傳代
培養(yǎng)當(dāng)成纖維細(xì)胞長至培養(yǎng)皿（瓶）底壁85%左右時(shí)，用PBS清洗3次，再用槍頭吸凈培養(yǎng)皿（瓶）里的PBS，加入0.125%胰酶（含0.01%EDTA）37℃消化5min左右后，在倒置相差顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開始變圓并有少量細(xì)胞脫落時(shí)，加高糖DMEM+15%FBS液終止消化，吹打細(xì)胞使其完全脫落，以1∶2或1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察傳代細(xì)胞生長增殖狀況，并拍照。傳代培養(yǎng)液與原代培養(yǎng)液相同。
1.2.3成纖維細(xì)胞冷凍與復(fù)蘇細(xì)胞冷凍：
0.125%胰酶（含0.01%EDTA）消化收集細(xì)胞，1 500 r/min離心5min，棄上清，用高糖DMEM+30%FBS+10%二甲基亞砜（DMSO）凍存液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107～3×107/mL，充分混勻，分裝在凍存管中。凍存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱、凍存管編號(hào)、性別和凍存日期。然后放入程序降溫盒中，于-80℃冰箱過夜，次日投入液氮罐中長期保存。
細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮中取出凍存管，迅速投入42℃水浴鍋中，不停搖動(dòng)使其受熱均勻達(dá)1 min，轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，移至培養(yǎng)皿（瓶）中，在（37℃，5%CO2，飽和濕度）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察復(fù)蘇細(xì)胞生長狀況，并拍照。
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