摘要：從黃河三角洲鹽堿地土壤分離到一株耐高鹽菌株NM-1.對該菌株生理生化性質、耐鹽性以及系統(tǒng)分類位置進行了分析。結果表明：菌株NM-1為長桿狀，革蘭氏陰性，菌落黃色，呈圓形，濕潤、光滑。能利用葡萄糖、乳糖和蔗糖，不能利用淀粉和明膠。生長pH范圍為8.0——10.0,最高耐鹽濃度（NaCl）為30%,為中度嗜鹽微生物，最適生長的Na2CO3濃度為0.25 M.16S rDNA序列分析表明：該菌株與Halomonas variabilis（JN645866）以及Halomonas variabilis（AY204638）序列的相似性均為98%,結合其形態(tài)、生理生化性質，認定該菌株屬于耐鹽單胞菌屬，暫命名為Halomonas sp.NM-1（AB917466）。
我國北方如黃河三角洲以及內蒙古等地廣泛分布著大面積的鹽堿地，在這些高鹽環(huán)境中生長的微生物群體由于長期適應環(huán)境，逐漸形成了極為特殊的耐鹽機制，具有很高的研究和利用價值。
目前，已發(fā)現(xiàn)的中度嗜鹽菌多為鹽單胞菌屬（Halomonas）的革蘭氏陰性菌、好氣桿菌。該屬是1980年Vreeland等鑒定出伸長鹽單胞菌（Halomonaselongate）時首次提出的。也有其他科的好氧或兼性厭氧菌，包括革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、產甲烷菌和嚴格厭氧細菌。耐鹽單胞菌是一類能在絕對鹽度（NaCl）為0%——32%條件下生長的耐鹽細菌。目前報道的鹽單胞菌屬細菌都生長在高鹽環(huán)境，如鹽場和鹽湖、鹽水濕地、鹽漬土、海水、海生生物、深海熱液噴口、鹽堿地。
作者從黃河三角洲鹽堿地土壤中分離一株高耐鹽菌，對其形態(tài)、生理生化性質、耐鹽能力以及16S rDNA基因序列進行了解析，以期為開發(fā)和利用耐鹽菌種資源奠定一定的理論基礎。
1材料與方法
1.1試樣及培養(yǎng)基
土壤樣品采集于黃河三角洲鹽堿地，共選取11個采樣點，將各點表層（3——30 cm）土壤采集后混勻，立即裝入滅菌的密封袋中，土樣帶回實驗室后立即對菌進行富集和分離。剩余樣品儲存于4℃冰箱中待用。
富集培養(yǎng)基成分：（NH4）2SO41 g,K2HPO47 g,KH2PO43 g,MgSO4·7H2O 0.1 g,葡萄糖10 g,蒸餾水1000 mL.分離培養(yǎng)基成分：酵母膏10 g,蛋白胨7.5 g,檸檬酸鈉3.0 g,KCl 2.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,FeSO4·7H2O 0.036 g,NaCl 20.0 g,Na2CO310.0 g,蒸餾水1000 mL,pH用鹽酸或氫氧化鈉調節(jié)。富集培養(yǎng)基及分離培養(yǎng)基均在121℃滅菌20 min后使用，制備固體平板培養(yǎng)基時加入15 g·L-1瓊脂，制備半固體培養(yǎng)基時加入2 g·L-1瓊脂。
1.2耐鹽細菌的富集、分離和篩選
稱量5 g土樣加入盛有45 mL無菌水的燒杯中，攪拌，使土壤溶解，靜置20 min,取土壤浸出液10 mL加入盛有200 mL已滅菌的富集培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)6 d（130 r·min-1,30℃），取3 mL上述培養(yǎng)液轉接到新鮮的富集培養(yǎng)基中，重復培養(yǎng)3次，培養(yǎng)條件同上，得到耐鹽堿細菌富集液。
1.3生理生化性質測定
對上述純化得到的單菌落用耐鹽菌富集液體培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)，得到富集培養(yǎng)液，對其生理生化性質進行測定，測定指標包括革蘭氏染色、MR實驗、V.P實驗、明膠水解實驗、淀粉水解實驗、糖發(fā)酵實驗、H2O2酶測定，操作方法見參考文獻.
1.4不同pH對耐鹽堿菌生長的影響
所用培養(yǎng)基為富集培養(yǎng)基。用NaOH調整培養(yǎng)基pH分別為8、9、10、11和12.分裝150 mL于250 mL三角瓶中，121℃滅菌20 min,冷卻，然后接種1.5 mL富集培養(yǎng)液（109cfu·mL-1）。培養(yǎng)條件為恒溫振蕩培養(yǎng)（130 r·min-1,30℃），每隔24 h定期取培養(yǎng)液，測定其吸光度（OD），波長采用560 nm,平行測定3個重復。
1.5不同NaCl濃度對菌生長的影響
向富集培養(yǎng)基中加入NaCl,分別配制成含10%、20%和30%的NaCl溶液，調整pH為9.0,接種、培養(yǎng)以及吸光度測定均同1.4,平行測定3個重復。
1.6不同Na2CO3濃度對菌株生長的影響
向富集培養(yǎng)基中加入不同質量的Na2CO3,使Na2CO3濃度分別為0、0.2、0.25、0.3 M,121℃滅菌20 min,接種富集培養(yǎng)液并定期測定菌液吸光度OD560,培養(yǎng)條件及測定方法同1.4,平行做3個重復。
1.7耐鹽菌DNA的提取、PCR反應及系統(tǒng)樹的創(chuàng)建
1.7.1細菌DNA提取
采用UNIQ-10柱式細菌基因組抽提試劑盒（上海生物工程有限公司）對菌株進行DNA提取，提取步驟按照試劑盒說明書進行。
1.7.2引物
采用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，引物序列：7F:5‘-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’;1540R:5‘-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’.
1.7.3PCR反應條件
1.7.4系統(tǒng)發(fā)育樹的創(chuàng)建及分類學位置的確定
利用DDBJ（DNA Data Bank of Japan,http://www.ddbj.nig.ac.jp/）數(shù)據庫，把分離菌株測得的16S rDNA序列進行序列比較，與相似度高的16S rDNA序列創(chuàng)建系統(tǒng)發(fā)育樹，所用軟件為CustalX2.1和Mega5（Molecular Evolutionary Genetics Analysis），系統(tǒng)進化距離矩陣根據Kimura模型估算，創(chuàng)建方法為鄰接法（Neighbor-Joining）。
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