3.4菌株的產(chǎn)酸能力試驗(yàn)
將篩選出的4株乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分析其產(chǎn)酸能力，見圖2。
圖2 24 h內(nèi)乳酸菌產(chǎn)酸能力
如圖2所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，4株菌株培養(yǎng)液的pH值均呈下降趨勢(shì)，培養(yǎng)初期pH值隨時(shí)間的變化不斷下降，培養(yǎng)16 h后，菌株培養(yǎng)液的pH值下降緩慢，與菌株的生長(zhǎng)曲線大體一致。培養(yǎng)至24 h時(shí)，菌株培養(yǎng)液pH值可達(dá)到4.40以下。結(jié)合生長(zhǎng)曲線與產(chǎn)酸能力，在臭鱖魚加工過程中，發(fā)酵初期腸球菌能迅速繁殖，產(chǎn)生乳酸，快速降低環(huán)境體系中pH值，為發(fā)酵與其他乳酸菌生長(zhǎng)創(chuàng)造良好的條件。
3.5菌株耐溫性試驗(yàn)
將乳酸菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在不同溫度下培養(yǎng)，分析其耐溫性，見圖3。
圖3乳酸菌在不同溫度下的生長(zhǎng)情況
如圖3所示，4株菌在15～45℃下都能生長(zhǎng)，在25～40℃下生長(zhǎng)情況基本良好;45℃時(shí)腸球菌的生長(zhǎng)情況相對(duì)于乳桿菌好。說明4株菌在25～40℃適宜生長(zhǎng)。以目前臭鱖魚的傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，發(fā)酵溫度為25～30℃，篩選出的4株菌能在此范圍良好生長(zhǎng)。
3.6菌株16s rDNA分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建
3.6.1菌株基因組DNA提取
利用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取菌株的基因組DNA，并采用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，得到的檢測(cè)電泳圖只有1個(gè)條帶，如圖4所示，可進(jìn)行16S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增。
圖4菌株基因組DNA檢測(cè)電泳圖
3.6.2 16S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增
將菌株的基因組DNA進(jìn)行16S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增，同時(shí)進(jìn)行PCR陰性對(duì)照試驗(yàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖5所示，PCR陰性對(duì)照無條帶，各菌株P(guān)CR產(chǎn)物條帶單一，在1 500bp處有特異性條帶，滿足測(cè)序的要求。
3.6.3 16S rDNA同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的建立
圖5菌株P(guān)CR擴(kuò)增凝膠電泳圖
利用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，將所測(cè)定的4株菌株的16S rDNA序列，與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中已知細(xì)菌的16S rDNA/rRNA序列進(jìn)行比較鑒定，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種。得到菌株L4的16S rDNA序列與屎腸球菌(Enterococcus faecium)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高;菌株L12的16S rDNA序列與彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高;菌株L20的16S rDNA序列與堅(jiān)強(qiáng)腸球菌(Enterococcus durans)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高;菌株L36的16S rDNA序列與干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高。
從GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中，提取已知的標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA/DNA基因序列，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得目的菌的分類地位或它的系統(tǒng)發(fā)育地位。如圖6所示，菌株L4與屎腸球菌(Enterococcus faecium)的系統(tǒng)位置最接近，菌株L20與堅(jiān)強(qiáng)腸球菌(Enterococcus durans)的系統(tǒng)位置最接近;菌株L12與彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)的系統(tǒng)位置最近;菌株L36與干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)的系統(tǒng)位置最接近。
圖6優(yōu)良乳酸菌L4、L12、L20、L36的系統(tǒng)發(fā)育樹
根據(jù)16S rDNA同源性對(duì)比結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株L4鑒定為屎腸球菌(Enterococcus faecium)，L12鑒定為彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)，L20鑒定為堅(jiān)強(qiáng)腸球菌(Enterococcus durans)，L36鑒定為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。
4結(jié)論
(1)依據(jù)肉制品發(fā)酵劑的篩選標(biāo)準(zhǔn)，本文通過對(duì)臭鱖魚中菌株的耐鹽、耐酸、耐亞硝酸鹽、產(chǎn)酸能力、生產(chǎn)曲線和耐溫性等一系列指標(biāo)的研究，篩選出4株菌都符合肉制品發(fā)酵劑的標(biāo)準(zhǔn)，具有良好的生長(zhǎng)性能和NaCl耐受性。
(2)經(jīng)過生理生化鑒定與16S rDNA序列測(cè)定分析，鑒定L4為屎腸球菌，L12為彎曲乳桿菌，L20為堅(jiān)強(qiáng)腸球菌，L36為干酪乳桿菌。為進(jìn)一步探討乳酸菌在水產(chǎn)制品中的應(yīng)用提供依據(jù)。
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