牛腸道病毒（Bovine enterovirus，BEV）屬于小RNA病毒科、腸道病毒屬，病毒粒子呈球形，無囊膜，直徑30~40 nm。BEV為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約7500 nt，包括5'非編碼區(qū)（5'untranslated region，5'UTR）、一個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）及3'非編碼區(qū)（3'untranslated region，3'UTR）。ORF編碼一個(gè)大的多聚蛋白，經(jīng)過一系列酶解后產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4）和非結(jié)構(gòu)蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）。
BEV感染牛一般引起輕度的腹瀉癥狀，也可侵犯其他器官而引起呼吸系統(tǒng)疾病或流產(chǎn)，同時(shí)存在隱性感染。從患腹瀉、肺炎、呼吸系統(tǒng)疾病及生殖障礙疾病的牛分泌物或排泄物中可分離獲得BEV，也可以從正常牛的糞便樣品中分離出。
1959年Moll和Davis首次分離獲得BEV，隨后很多國家和地區(qū)相繼報(bào)道了BEV的分離鑒定。國外牛群中BEV的血清學(xué)陽性率為17.6%~80%。中國有關(guān)BEV的病原學(xué)及流行病學(xué)調(diào)查相對較少。2011年李英利等首次在中國國內(nèi)報(bào)道了牛腸道病毒的分離鑒定，隨后又從北京市分離到1株牛腸道病毒。2013年彭小薇等從北京市某牛場嚴(yán)重腹瀉的泌乳奶牛直腸拭子中分離獲得1株牛腸道病毒，并進(jìn)行了全基因組序列測定。2013年第九次病毒分類報(bào)告將BEV重新分類為EV-E與EV-F。分子進(jìn)化樹分析表明以上2株牛腸道病毒中國分離株（BHM-26、BJ50和BJ001）均為EV-F2。2014年邢澤黎等從吉林省肉牛場新發(fā)疫病分離出E種腸道病毒。2015年張海麗等從山西省某奶牛場的泌乳奶牛糞便樣品中分離得到1株牛腸道病毒，分析其可能為EV-E。
本實(shí)驗(yàn)室2017年1月從內(nèi)蒙古發(fā)生呼吸道疾病的某牛場采集牛鼻拭子，用MDBK細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，獲得1株病毒。經(jīng)電鏡觀察、理化特性鑒定和序列分析表明該分離株為牛腸道病毒，命名為NM575，這是國內(nèi)首次從表現(xiàn)呼吸道疾病的牛鼻拭子中分離到牛腸道病毒。
1材料和方法
1.1病料
內(nèi)蒙古某牛場發(fā)生呼吸道疾病，病牛表現(xiàn)精神沉郁、流涕、咳嗽和呼吸窘迫等癥狀。采集30頭牛的鼻拭子于含3%小牛血清的MEM中，冰袋保存并迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。
1.2主要試劑
MDBK細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自AXYGEN公司；反轉(zhuǎn)錄酶和pMD18-T載體購自TaKaRa公司；dNTP、DEPC水、DNA Marker（DL2000）均購自Thermo公司。
1.3樣品處理與病毒分離
將鼻拭子浸出液經(jīng)0.45μm濾器過濾后接種于24孔板培養(yǎng)的MDBK單層細(xì)胞，每孔100μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h后換液，逐日觀察細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）。未出現(xiàn)CPE的盲傳3代后，出現(xiàn)CPE后繼續(xù)傳代，當(dāng)CPE達(dá)到80%時(shí)收毒，－70℃保存。
1.4病毒含量的測定（TCID50）
將分離株F4用維持培養(yǎng)液稀釋至10-9，每個(gè)稀釋度做8個(gè)重復(fù)，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的MDBK細(xì)胞（100μL/孔），并設(shè)正常細(xì)胞對照，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞病變，共培養(yǎng)4 d，記錄細(xì)胞病變孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算TCID50。
1.5電鏡觀察
將分離病毒接種MDBK細(xì)胞，待80%出現(xiàn)CPE后反復(fù)凍融3次收毒，2400×g離心15 min，取上清，再經(jīng)4℃、13 800×g離心30 min，取沉淀，2%磷鎢酸負(fù)染，進(jìn)行電鏡觀察。
1.6病毒的理化特性鑒定
對該病毒進(jìn)行核酸型鑒定、乙醚敏感性試驗(yàn)、氯仿敏感性試驗(yàn)、胰蛋白酶敏感性試驗(yàn)、耐熱性試驗(yàn)、耐酸性試驗(yàn)等理化特性鑒定。
1.6.1病毒的核酸型鑒定
將MDBK傳至96孔板，待其長至單層，將已知的RNA病毒牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）和DNA病毒牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）與分離的病毒NM575，分別用含100μg/mL的DNA抑制劑5-溴脫氧尿苷（BRDU）的維持液稀釋至100 TCID50，然后接種至MDBK細(xì)胞，同時(shí)設(shè)100μg/mL BRDU細(xì)胞對照組。每日觀察CPE，48 h后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次后，接種至96孔板上長至單層的MDBK細(xì)胞，48 h后記錄CPE情況并計(jì)算TCID50。
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