1.4單因素分析誘導(dǎo)表達(dá)條件
1.4.1誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的影響
將培養(yǎng)過夜的重組菌株BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24菌液加到300 mL含100μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，體積比為1∶100，37℃搖床培養(yǎng)2.5 h至D600nm值為0.6時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，于37℃搖床中振蕩培養(yǎng)，分別于0、1、2、3、4、5、6、7和8 h取樣，4℃、12 000 r/min離心5 min收集各樣品中的菌體，分別加入160μL 1×Tris-HCl和40μL 5×SDS上樣緩沖液，充分混勻后沸水浴10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行12%的SDS-PAGE，用Gel DOC凝膠成像系統(tǒng)分析各樣品中重組蛋白占總蛋白的百分含量，確定重組菌BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。
1.4.2培養(yǎng)基pH值對(duì)CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的影響
將培養(yǎng)過夜的重組菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24按體積比1∶100加到pH值分別為4、5、6、7、8、9和10的含100μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2.5 h至D600nm值為0.6時(shí)，分別加入終濃度為1.0 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，振蕩培養(yǎng)4 h，取樣進(jìn)行12%的SDS-PAGE，用Gel DOC凝膠成像系統(tǒng)分析各樣品中重組蛋白占總蛋白的百分含量，確定重組菌BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24蛋白表達(dá)的最佳培養(yǎng)pH值范圍。
1.4.3誘導(dǎo)溫度對(duì)CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的影響
將培養(yǎng)過夜的重組菌BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24按體積比1∶100分別加到含100μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2.5 h至D600nm值為0.6時(shí)，分別加入終濃度為1.0 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，分別于17、22、27、32、37、42℃振蕩培養(yǎng)4 h，取樣進(jìn)行12%的SDS-PAGE，用Gel DOC凝膠成像系統(tǒng)分析各樣品中重組蛋白占總蛋白的百分含量，確定BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24工程菌蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)溫度。
1.4.4誘導(dǎo)劑IPTG濃度對(duì)CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的影響
將培養(yǎng)過夜的重組菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24按體積比1∶100分別加到含100μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2.5 h至D600nm值為0.6時(shí)，分別加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.00、0.03、0.06、0.12、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L，37℃振蕩培養(yǎng)4 h，取樣進(jìn)行12%的SDS-PAGE，用Gel DOC凝膠成像系統(tǒng)分析各樣品中重組蛋白占總蛋白的百分含量，確定BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24工程菌蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)劑IPTG濃度。
1.5正交設(shè)計(jì)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件
根據(jù)單因素分析結(jié)果，用正交設(shè)計(jì)助手V3.1設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L25（45），以不同誘導(dǎo)時(shí)間（2、3、4、5、6 h）、不同培養(yǎng)基pH值（6、6.5、7、7.5、8）、不同誘導(dǎo)溫度（32、34.5、37、39.5、42℃）和不同誘導(dǎo)劑IPTG濃度（0.03、0.06、0.12、0.25、0.50 mmol/L）四因素五水平進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化，研究BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24工程菌高水平表達(dá)的規(guī)律。
2結(jié)果
2.1 BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24重組菌株的生長(zhǎng)曲線分析
生長(zhǎng)曲線反映了工程菌的生長(zhǎng)變化趨勢(shì)，可以確定該重組菌株在某一時(shí)刻所處的生長(zhǎng)階段，依此為依據(jù)，選擇合適的誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)。由BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24重組菌株的生長(zhǎng)曲線（圖1）可見，培養(yǎng)2～3 h時(shí)菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
圖1重組菌株BL21/p ET21b-CSP-MDA-7/IL-24的生長(zhǎng)曲線
2.2單因素分析誘導(dǎo)表達(dá)條件
2.2.1誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的影響
首先考察了不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)CSP-MDA-7/IL-24融合基因表達(dá)的影響。結(jié)果見圖2，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，CSP-MDA-7/IL-24蛋白表達(dá)量也在逐漸增加，在加入IPTG誘導(dǎo)4 h后，重組蛋白表達(dá)量達(dá)到高峰，占菌體總蛋白的49.5%。但隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，雜蛋白也在不斷增加，所以4 h為誘導(dǎo)最佳時(shí)間。
圖2不同誘導(dǎo)時(shí)間重組菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)蛋白的SDS-PAGE
2.2.2培養(yǎng)基pH值對(duì)CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)的影響
對(duì)培養(yǎng)基不同pH值的考察結(jié)果見圖3，在其他誘導(dǎo)條件相同的情況下，培養(yǎng)基pH值為6～8時(shí)適宜CSP-MDA-7/IL-24表達(dá)，pH值為7.0時(shí)目的蛋白表達(dá)達(dá)高峰，占菌體總蛋白的89.6%。
圖3培養(yǎng)基不同pH值時(shí)重組菌
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