1.4噬菌體宿主范圍


利用實(shí)驗(yàn)室從明永冰川地區(qū)分離、鑒定的菌株進(jìn)行噬菌體宿主范圍評(píng)估，包括Flavobacteriumsp.M YBO1，Pseudomonos sp.M YB05，Paenibaeillussp.MYB09，Chromobacterium sp.MYB10，Pseudom-onossp.MYB15等37株低溫菌。將MYSP03、MYSP08和MYTP08純培養(yǎng)液經(jīng)0.22 m微孔濾膜過濾后，取100分別與300處于對(duì)數(shù)期的上述菌懸液混勻，15℃吸附10min后倒雙層平板，于15℃恒溫培養(yǎng)24～48h，觀察出斑情況。同時(shí)以不加宿主菌的噬菌體純培養(yǎng)液和不加噬菌體的宿主菌懸液作陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。


1.5噬菌體電鏡形態(tài)觀察


參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，取噬菌體純培養(yǎng)液2L，加入PEG8000至終濃度為10％(w，v)，4℃靜置過夜處理后10000r／min離心收集沉淀，經(jīng)SM緩沖液重懸后利用氯化銫平衡密度梯度離心純化噬菌體顆粒。磷鎢酸染色后用透射電子顯微鏡H一7650觀察。


1.6物理及化學(xué)因素對(duì)噬菌體活性影響


1.6.1溫度對(duì)噬菌體增殖活性的影響取效價(jià)


為1xl0。pfu／mL的噬菌體純培養(yǎng)液100 txL與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宿主菌懸液按照MOI=10混勻，15℃溫育吸附10min后補(bǔ)充體積至6mL，分別于4、l0、15、18、20、25o振蕩培養(yǎng)6h，通過雙層平板法測(cè)定培養(yǎng)液中的噬菌體效價(jià)。同時(shí)以不加噬菌體的宿主菌和不加宿主菌的噬菌體作對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。


1.6.2噬菌體的熱穩(wěn)定性研究


取效價(jià)為1xl0 pfu／mL的噬菌體純培養(yǎng)液100分別于40、5O、6O、70℃溫育處理30rain，測(cè)定不同溫度下樣品中的噬菌體效價(jià)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。


1.6.3 pH對(duì)噬茵體活性的影響


取效價(jià)為1xl0’pfu／mL的噬菌體純培養(yǎng)液100 L加入1mL不同pH的緩沖液中(pH 3～11)，室溫下處理1h后測(cè)定不同緩沖液中的噬菌體效價(jià)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。


1.6.4化學(xué)試劑敏感性研究


取效價(jià)為lxl09pfu／mL的噬菌體純培養(yǎng)液1mL分別經(jīng)氯仿(25％wt／v，室溫處理10min)、SDS(0.1％wth，50℃處理6min)、Triton)(-100(0.3％wt／v，室溫處理10min)和蛋白酶K(1mg／mL，56℃處理1h)處理，測(cè)定不同樣品中的噬菌體效價(jià)。


1.7吸附速率的測(cè)定


將效價(jià)為lxl0 pfu／mL噬菌體純培養(yǎng)液與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宿主菌懸液按照MOI=10混勻，15qC溫育吸附，同時(shí)從0時(shí)刻開始在2、4、6、8、10、15、20、30min取樣100IxL，13000r／min離心5min，測(cè)定上清液中噬菌體效價(jià)，同時(shí)以不加噬菌體的宿主菌和不加宿主菌的噬菌體作對(duì)照。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，噬菌體效價(jià)為縱坐標(biāo)，繪制吸附速率曲線。


1.8最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定


參照Lu等的方法，略有改動(dòng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宿主菌與噬菌體純培養(yǎng)液稀釋為lx10。cfu／mL和1xl0 pfu／mL，按照MOI為O.001、0.01、0.1、1、10和100加人噬菌體純培養(yǎng)液和宿主菌，補(bǔ)充PYGV液體培養(yǎng)基平衡各管體積。l5℃、160dmin振蕩培養(yǎng)3.5h后離心，雙層平板法測(cè)定上清液中噬菌體效價(jià)，實(shí)驗(yàn)作雙份復(fù)管培養(yǎng)取平均值。同時(shí)以不加噬菌體的宿主菌和不加宿主菌的噬菌體作對(duì)照，測(cè)得子代噬菌體效價(jià)最高者所對(duì)應(yīng)的MOI即為最佳感染復(fù)數(shù)。


1.9一步生長(zhǎng)曲線的繪制


將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宿主菌稀釋為1xl0cfu／mL，加入噬菌體純培養(yǎng)液使得MOI=10。15℃吸附15min，經(jīng)13000r／min離心5min，棄上清，用15℃溫育的PYGV新鮮液體培養(yǎng)基洗滌兩次，加入5mL新鮮液體培養(yǎng)基重懸沉淀后迅速置于15℃搖床中160r／min振蕩培養(yǎng)，同時(shí)開始計(jì)時(shí)，自0時(shí)刻開始，每隔10min取樣50，利用雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)。各點(diǎn)均作雙份復(fù)管取平均值，同時(shí)以不加宿主菌的噬菌體和不加噬菌體的宿主菌作對(duì)照。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，測(cè)得培養(yǎng)體系中噬菌體的效價(jià)為縱坐標(biāo)，繪制一步生長(zhǎng)曲線。


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