2結(jié)果
2.1重配病毒鑒定
利用反向遺傳技術(shù)，構(gòu)建了包含JX346基因和A/PR/8/34病毒基因的2株重配病毒，一株重配病毒的表面基因HA和NA來(lái)自JX346，內(nèi)部基因來(lái)自PR8，命名為RG-H10N8；另外一株重配病毒的表面基因HA來(lái)自JX346，NA和內(nèi)部基因來(lái)自PR8，命名為RG-H10N1。
兩種重配病毒經(jīng)序列測(cè)定顯示，其HA基因與原始母本病毒比較氨基酸序列沒(méi)有差異，表明HA基因是來(lái)自母本病毒的H10亞型；NA基因經(jīng)序列測(cè)定顯示分別是NA1和NA8亞型，內(nèi)部基因來(lái)自PR8病毒，與預(yù)期相符，具體基因來(lái)源見(jiàn)圖1。
2.2在不同培養(yǎng)介質(zhì)上的病毒滴度測(cè)定
為了檢測(cè)兩株病毒在不同培養(yǎng)介質(zhì)上的敏感性，將病毒分別感染Vero、MDCK和SPF雞胚，同時(shí)以RG-PR8病毒做對(duì)照，結(jié)果顯示在雞胚和MDCK上，三株病毒均能檢測(cè)到病毒滴度，在MDCK細(xì)胞上的滴度從低至高分別相差約10倍，依次是RG-H10N8
圖1重配病毒基因來(lái)源示意圖
注：“V”Vero細(xì)胞；M：MDCK細(xì)胞；“/”：未檢測(cè)到病毒滴度；表中結(jié)果均是兩次檢測(cè)結(jié)果均值
2.3病毒生長(zhǎng)曲線
上述病毒滴度測(cè)定結(jié)果顯示MDCK細(xì)胞較Vero細(xì)胞對(duì)病毒更敏感，為了進(jìn)一步了解病毒在MDCK細(xì)胞上的生長(zhǎng)情況，將病毒分別以不同的MOI感染MDCK細(xì)胞，從圖2中的結(jié)果可見(jiàn)三株病毒在不同的MOI感染后均呈現(xiàn)HA滴度隨時(shí)間增加的趨勢(shì)；在MOI=0.1和MOI=0.01感染時(shí)，在24 h時(shí)三株病毒HA滴度相差不大，雖然所有病毒感染48 h后滴度均明顯上升，72 h后滴度繼續(xù)上升，同時(shí)鏡下觀察細(xì)胞CPE較48 h明顯，但是兩株H10重配病毒的HA滴度在48 h和72 h時(shí)均明顯低于RG-PR8病毒，重配病毒之間差異不大；在MOI=0.001時(shí)，三株病毒HA滴度均較低，病毒之間HA滴度差異不大。
圖2病毒以不同MOI感染MDCK細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線
3討論
近年來(lái)，禽流感病毒感染人的病例時(shí)有發(fā)生，感染人類(lèi)的病毒型別也不僅限于H5N1、H7N9和H9N2亞型，2013年首次報(bào)道人感染H10N8病例后，2014年又有2例感染病例報(bào)道，因此構(gòu)建H10亞型流感病毒疫苗株，并選擇合適的培養(yǎng)介質(zhì)是疫情防控的重要技術(shù)儲(chǔ)備；WHO推薦采用傳代細(xì)胞作為培養(yǎng)基質(zhì)，利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建重配病毒作為流感大流行相關(guān)禽流感病毒儲(chǔ)備疫苗株，即構(gòu)建含有HA和NA或僅含有HA基因，其余基因來(lái)自高產(chǎn)的PR8的重配病毒。重配病毒可以感染細(xì)胞或雞胚制備疫苗，但雞胚作為疫苗生產(chǎn)的基質(zhì)，可能引入外源性病毒污染，同時(shí)制備的疫苗產(chǎn)品均質(zhì)性差，因此選用合適的細(xì)胞生產(chǎn)疫苗是流感疫苗的發(fā)展趨勢(shì)，可使疫苗的抗原性更接近流行株；但不同的毒株對(duì)細(xì)胞的易感性不同，因此本研究就構(gòu)建的兩株H10重配病毒對(duì)MDCK和Vero細(xì)胞的易感性進(jìn)行了研究，為未來(lái)研究細(xì)胞基質(zhì)疫苗奠定基礎(chǔ)。
本研究病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在感染MDCK細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，兩株H10重配病毒均易感，在MOI=0.1和MOI=0.01感染時(shí)，病毒能達(dá)到較高的滴度但是低于PR8病毒。已有文獻(xiàn)報(bào)道Vero細(xì)胞在流感病毒疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用，但本研究結(jié)果顯示在Vero細(xì)胞上RG-H10N8檢測(cè)不到病毒滴度，可以檢測(cè)到RG-H10N1的滴度，序列分析顯示兩株H10重配病毒的HA基因完全相同，僅NA基因不同，說(shuō)明NA的不同會(huì)影響毒株對(duì)細(xì)胞的感染能力；但RG-H10N1檢測(cè)到病毒滴度也明顯低于在MDCK細(xì)胞中的培養(yǎng)滴度，說(shuō)明Vero細(xì)胞對(duì)H10重配病毒病毒不如MDCK細(xì)胞敏感，這與之前的文獻(xiàn)結(jié)論是一致的：即使是生長(zhǎng)能力良好的PR8病毒在Vero細(xì)胞上也需要適應(yīng)性傳代以獲得高滴度產(chǎn)物。
MDCK細(xì)胞是流感病毒分離培養(yǎng)的常用細(xì)胞，近年來(lái)用該細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗也獲得了較好的效果，本研究的結(jié)果表明MDCK細(xì)胞較Vero細(xì)胞對(duì)流感H10亞型重配病毒更敏感，可進(jìn)一步用于H10重配病毒細(xì)胞疫苗的培養(yǎng)基質(zhì)研究。
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