2結果與分析
2.1貝萊斯芽胞桿菌WB的生長促進能力分析
對WB菌株分泌IAA的能力進行測定，結果顯示，其水平從0到36 h呈上升趨勢，在36 h達到(129.73±8.73)μg/mL的峰值，隨著菌株生長進入衰亡期，其分泌IAA的水平也隨之下降(圖1A)。如圖1B所示，WB菌株和CK之間的總氮含量有顯著差異，表明WB菌株具有固氮能力。
如圖1C~1E所示，WB菌株能夠在產纖維素酶、解磷和解鉀培養(yǎng)基上產生透明的圓圈，表明WB菌株具有分解纖維素、解磷和解鉀的能力。
2.2貝萊斯芽胞桿菌WB處理對西瓜胚根生長的影響
為探索WB菌株對西瓜植株促生的最適濃度，采用不同濃度的WB菌懸液對已萌發(fā)的西瓜種子進行處理，結果顯示，與CK相比，不同濃度的WB菌懸液對已萌發(fā)的西瓜種子表現(xiàn)出不同的影響。WB菌懸液在不同濃度下對西瓜胚根生長的影響存在顯著性差異，在4.0×106 CFU/mL的濃度下對西瓜胚根的促生效果最佳，其次是在4.8×107 CFU/mL的濃度下(圖2)。
2.3貝萊斯芽胞桿菌WB對西瓜幼苗生長的促生效應
為進一步驗證WB菌株對西瓜幼苗的促生效應，每3 d用WB菌懸液(6.25×106 CFU/mL,40 mL)基因或基因ID處理西瓜幼苗1次，結果表明，經WB菌株處理的西瓜植株高度增加了67.55%(圖3A)，莖粗增加了78.41%(圖3B)，根干重增加了32.23%(圖3C)，根節(jié)點數(shù)增加了47.19%(圖3D)，根長增加了32.35%(圖3E)，地上鮮重增加了68.36%(圖3F)，說明WB菌株促進了西瓜植株的生長。
表1 用于qRT-PCR分析的基因和引物
2.4差異表達基因及其功能注釋
對接種貝萊斯芽胞桿菌WB懸浮液4 d和6 d的西瓜葉片的轉錄組數(shù)據進行分析，結果如圖4A所示，與對照組(CK)相比，菌株WB懸浮液處理4 d，共有498個DEGs，其中406個基因上調，92個基因下調。WB菌懸液處理6 d，與對照相比，共有494個DEGs，其中219個基因上調，275個基因下調(圖4B)。
利用GO功能注釋對DEGs進行功能分類，根據其功能將DEGs分為3大類：生物過程(biologicalprocess)、細胞組成(cellular component)和分子功能(molecular function)。如圖5所示，在生物過程類別中，涉及最多的DEGs是細胞過程(GO:0009987)和代謝過程(GO:0008152)；細胞組成的類別中涉及DEGs最多的是細胞部分(GO:0044464)和膜部分(GO:0044425)；分子功能類別中涉及DEGs最多的是結合基因(GO:0005488)和催化活性基因(GO:0003824)。KEGG功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，DEGs主要富集在5個主要類別：細胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝系統(tǒng)和生物體系統(tǒng)。
圖1 WB菌株促生能力測定
A.WB菌株的生長曲線和分泌IAA的能力。B.WB菌株固氮能力。**：差異極顯著(P＜0.01)；下同。C.WB菌株產纖維素酶能力。D.WB菌株的解鉀能力。E.WB菌株的解磷能力
圖2 WB菌株不同菌懸液濃度對西瓜胚根生長的影響
圖3 B.velezensis WB處理對西瓜幼苗生長的影響
A.株高。B.莖粗。C.根干重。D.根節(jié)點數(shù)。E.根長。F.鮮重。*：差異顯著(P＜0.05)；下同
圖4貝萊斯芽孢桿菌WB處理和CK西瓜植株間差異基因的火山圖
A.菌株WB處理西瓜植株4 d。B.B.velezensis WB處理西瓜植株6 d。下同
圖5貝萊斯芽孢桿菌WB處理和CK西瓜植株間差異基因的GO功能注釋
WB4 vsCK4處理中最突出的前4個KEGG過程包括：萜類和聚酮類的代謝(map00904)、碳水化合物的代謝(map00040)、氨基酸的代謝(map00270)和信號轉導(map04016,map04070和map04075)。代謝系統(tǒng)途徑包含最多的DEGs(72.82%)，其次是環(huán)境信息處理(9.71%)。在WB6 vs CK6處理中發(fā)現(xiàn)脂質代謝(map01040)也是DEGs富集的重要途徑。68.97%的DEGs富集在代謝系統(tǒng)的路徑中，12.07%的DEGs富集在環(huán)境信息處理的路徑中(圖6)。
2.5 KEGG富集分析
對WB4 vs CK4處理中的DEGs進行KEGG富集分析，如圖7所示，DEGs主要富集在與植物生長相關的一些途徑中。9個基因富集在苯丙烷類生物合成途徑中，6個基因富集在植物激素信號途徑中。
此外，4個基因在半萜和三萜類化合物的生物合成途徑中富集。WB6 vs CK6處理中有6個基因富集在苯丙烷類生物合成途徑中，6個基因富集在植物激素信號途徑中，2個基因富集在半萜和三萜類化合物的生物合成途徑中。這些結果表明，貝萊斯芽胞桿菌WB處理影響了西瓜植物中促進植物生長途徑的基因表達。
2.6貝萊斯芽胞桿菌WB誘導半萜和三萜類化合物及苯丙烷類生物合成途徑上的基因表達
半萜和三萜類化合物的生物合成途徑與植物生長有關。苯丙烷生物合成途徑也參與植物生長。表2中的數(shù)據結果表明，WB4 vs CK4處理中參與半萜和三萜類化合物的生物合成途徑和苯丙烷類生物合成途徑的基因被不同程度地上調。例如，與CK4相比，3個編碼香葉烯D(germacrene D,GERD)的基因(Cla97C10G190 250,Cla97C10G190240和Cla97C10G190260)上調了1.65~2.70倍。編碼橙花叔醇合成酶1(nerolidol synthase1,NES1)的基因上調了2.24倍。苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine am‐monia-lyase,PAL)是苯丙氨酸生物合成途徑中的一個關鍵酶。與CK6處理的西瓜植株相比，PAL相關的基因在WB6處理的西瓜植株中被上調了1.70倍。
編碼植物咖啡酸-O-甲基轉移酶(caffeic acid O?methyltransferase,COMT)和?-葡萄糖苷酶(β-Glu‐cosidase)的基因分別上調了2.18和3.00倍。過氧化物酶是苯丙烷類生物合成途徑中的一個關鍵酶。
圖6貝萊斯芽孢桿菌WB處理和CK西瓜植株間差異基因的KEGG功能注釋
圖7貝萊斯芽孢桿菌WB處理和CK間西瓜植株差異基因的KEGG富集分析
與CK4相比，2個過氧化物酶相關基因(Cla97C09G177290和Cla97C11G207220)上調了1.30和1.76倍。與CK6相比，3個過氧化物酶相關的基因(Cla97C02G049930,Cla97C04G070210和Cla97C 02G045070)被上調了1.07~1.89倍(表2)。
總之，貝萊斯芽胞桿菌WB不同程度地上調了半萜和三萜類化合物的生物合成途徑和苯丙烷生物合成途徑的基因。
2.7貝萊斯芽胞桿菌WB誘導西瓜的植物激素信號轉導和植物-病原體互作通路IAA是存在于植物中的一種常見的重要植物激素，能促進植物的生長發(fā)育，植物激素信號轉導是合成IAA的重要信號途徑，對植物生長有重要的促進作用。WB4 vs CK4處理中編碼IAA的3個基因(Cla97C07G140170,Cla97C06G117070和Cla97C11G213210)上調了1.06~1.25倍，編碼組氨酸磷酸轉運蛋白(Arabidop?sis histidine phosphotransfer proteins,AHP)的2個基因(Cla97C06G115080和Cla97C08G155240)分別上調了1.56和1.30倍(表2)。編碼A型反應調節(jié)子(Arabidopsis response regulator,ARR-A)的基因(Cla97C01G007850)被上調了1.35倍。同樣，在貝萊斯芽胞桿菌WB菌懸液處理6 d時，編碼IAA和與乙烯有關的基因也出現(xiàn)了不同程度的上調(表2)。編碼類鈣調素(calmodulin-like,CML)的基因Cla97C02G038500上調了1.26倍。綜上，西瓜植株在接種WB菌株后激活了植物信號轉導途徑中與促進生長有關基因的表達。
表2不同促生長信號通路中DEGs的功能
圖8貝萊斯芽孢桿菌WB處理4 d(A)和6 d(B)西瓜植株上調表達的轉錄因子
2.8貝萊斯芽胞桿菌WB誘導參與植物抵抗西瓜專化型尖胞鐮刀菌(Fon)的轉錄因子的表達轉錄因子(transcription factors,TFs)是植物生長、發(fā)育和脅迫反應的主要調控者。
如圖8所示，菌株WB處理4和6 d分別上調了10個轉錄因子的表達。這些轉錄因子包括MYB(my‐eloblastosis)、NAC(NAM,ATAF and CUC)、Dof(DNA binding with one finger)、SBP(SQUAMOSApromoter-binding protein)、TCP(teosintebranched lcycloidea proliferating)和ERF(ethylene responsivefactor)等。所有這些轉錄因子都與植物生長和發(fā)育有關，表明WB菌株可以通過上調西瓜中的轉錄因子的表達來調節(jié)西瓜植物的生長。
2.9 qRT-PCR驗證
為了驗證RNA-seq的數(shù)據，本研究對與促生有關的差異基因表達進行了qRT-PCR驗證。在RNA-seq數(shù)據中，經過驗證的基因，包括半萜和三萜類化合物的生物合成途徑中的香葉烯D(ger‐macrene D,GERD)基因(Cla97C10G190250)在WB4vs CK4處理中上調了6.14倍，苯丙烷類生物合成途徑中的過氧化物酶(peroxidase,E1.11.1.7)基因(Cla97C09G177290)上調了2.08倍，植物與病原體相互作用途徑中的CML基因(Cla97C02G038500)和植物激素信號途徑中的IAA基因(Cla97C07G140170)分別上調了2.37和1.96倍。對上述4個DEGs的qRT-PCR分析表明，其表達趨勢與RNA-seq的結果一致(圖9)。
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