目錄
一、無菌室的要求
二、樣品準備
三、培養(yǎng)基與試劑制備的制備和殺菌
四、微生物實驗操作
五、微生物實驗室廢棄物處理
六、實驗結(jié)果報告
七、實驗室設備的校準、維護和性能驗證
一.微生物無菌室基本要求及管理
1.1無菌室的基本建設要求
1.1.1根據(jù)本實驗室所涉及的生物安全等級，無菌室的設計和建設應符合GB 50364和GB 19489的相關要求。
1.1.2無菌室大小應能夠滿足檢驗工作的需要，內(nèi)墻為淺色，地面和地面應光滑，墻壁與地面、天花板連接處應呈凹弧形，無縫隙，無死角，易于清潔和消毒。
1.1.3無菌室入口處應設置緩沖間，緩沖間內(nèi)應安裝非手動式開關的洗手盆，并可有毛巾。緩沖間應有足夠的面積以保證操作人員更換工作服及鞋帽。
1.1.4無菌室內(nèi)工作臺的高度約80cm,工作臺應保持水平，工作臺二應無滲漏，耐腐蝕，易于清潔、消毒。
1.1.5無菌室內(nèi)光照應分布均勻，工作臺面的光照度應不低于540Ix。
1.1.6無菌室應具備適當?shù)耐L和溫度調(diào)節(jié)的條件。無菌室的推薦溫度為20℃，相對濕度為40%~60%。
1.1.7緩沖間及操作室內(nèi)均應設置能達到空氣消毒效果的紫外燈或其他適宜的消毒裝置。
1.2無菌室的管理
1.2.1無菌室在使用前和使用后應進行有效的消毒。
1.2.2無菌室的滅菌效果應至少每兩周驗證一次。
1.2.3應制定清潔、消毒、滅菌、使用和應急處理程序。
1.2.4應記錄環(huán)境檢測結(jié)果，并歸檔保存。
1.2.5不符合規(guī)定時應立即停止使用
1.3微生物實驗室消毒處理方法
1.3.1無菌室
1.3.1.1紫外線消毒
（1）在室溫20℃~25℃時，220V30W紫外燈下方垂直位置1.0m處的253.7nm紫外線輻射強度應70W/cm2,低于此值時應更換，適當數(shù)量的紫外燈，確保平均每立方米應不少于1.5W。
（2）紫外線消毒時，無菌室內(nèi)應保持清潔干燥。
（3）在無人條件下，可采取紫外線消毒，作用時間應30min,室內(nèi)濕度20%或40%、相對濕度大于60%時，應適當延長照射時間。
（4）用紫外線消毒物品表面時，應使照射表面受到紫外線的直接照射，且應達到足夠的照射劑量。
（5）人員在關閉紫外燈至少30min后方可入內(nèi)作業(yè)。
（6）按照GB 15981的規(guī)定，評價紫外線的消毒與殺菌效果。
1.3.1.2臭氧消毒
（1）封閉無菌室內(nèi)，無人條件下，采用20mg/m3濃度的臭氧,作用時間應30min。消毒后室內(nèi)臭氧濃度0.2mg/m3時方可入內(nèi)作業(yè)。
（2）按照GB/T 18202的規(guī)定，檢測室內(nèi)臭氧的濃度。
1.3.1.3無菌室空氣滅菌效果驗證方法(沉降法)
（1）在消毒處理后與開展檢驗活動之前期間采樣。
（2）取樣點的選擇應基于人員流量情況和做試驗的頻率。一般情況下，無菌室面積30m2時，從所設定的條對角線選取3點，即中心1點，兩端各距離墻1m處各取1點；無菌室面積30m2時，選取東西北中5點，其中東點、南點、西點、北點均距離墻lm。
1.3.2生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生指標:
裝配與包裝車間空氣中細菌菌落總數(shù)應≤2500CFU/m3
工作臺表面細菌菌落總數(shù)應≤20CFU/cm2
工人手表面細菌菌落總數(shù)應≤300CFU/只手，并不得檢出致病菌。
二.樣品的準備
食品生產(chǎn)線每兩小時取樣1次，異常停機時再取一次。每天取樣12瓶，然后在12瓶中隨機抽取3瓶做微生物檢測。
做微生物之前，在緩沖間用75%的酒精對樣品外表進行殺菌。之后送到傳遞窗口處。避免樣品對無菌間造成二次污染。
2.1工作臺面與工人手表面采樣與測試方法
2.1.1樣品采集
工作臺:將經(jīng)滅菌的內(nèi)徑為5cm*5cm的滅菌規(guī)格板放在被檢物體表面，用以浸有滅菌生理鹽水的棉簽在其內(nèi)涂抹10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。
工人手:被檢人五指并攏，用以浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲面，從指尖到指端來回涂擦10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。
2.1.2細菌菌落總數(shù)檢測
將已采集的樣品在6h內(nèi)送實驗室，每支采樣管充分混勻后取1mL樣液，放入滅菌平皿內(nèi)，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每個樣品平行接種兩個平皿，置36℃土2℃培養(yǎng)48h,計數(shù)平板上細菌菌落數(shù)。
2.2空氣采樣與測試方法
2.2.1樣品采集
在動態(tài)下進行。
室內(nèi)面積不超過30m3，在對角線上設里中外三點:里、外點位置距墻1m;室內(nèi)面積超過30m3,設東西南北中5點，周圍4點距墻1m。采樣時，將含營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的平板(真徑9cm)置采樣點(約桌面高度)，打開平皿蓋，使平板在空氣中暴露5min。
2.2.2細菌培養(yǎng)
在采樣前將準備好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置36℃土2℃培養(yǎng)24h,取出檢查有無污染，將污染培養(yǎng)基剔除。
將已采集的培養(yǎng)基在6h內(nèi)送實驗室，于36℃土2℃培養(yǎng)48h,觀察結(jié)果，計數(shù)平板上細菌菌落數(shù)。
三、培養(yǎng)基與試劑制備的制備和殺菌
3.1試劑的配制
3.1.1無菌生理鹽水的配制
用精確到0.01g的電子稱稱取8.5g微生物檢測專用鹽，在100mL燒杯中用二次凈化水溶解后，轉(zhuǎn)移到1000mL的無色透明的容量瓶并用二次凈化水定容到1000mL備用。
3.1.2營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配制
稱取35g營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用二次凈化水在250mL的燒杯中溶解后，轉(zhuǎn)移到1000mL的無色透明的容量瓶并用二次凈化水定容到1000mL。然后用250mL的錐形瓶分裝備用。
3.2試劑的分裝
3.2.1生理鹽水的分裝
將配置好的生理鹽水用500mL的量筒按照每個錐形瓶裝225mL的量進行分裝。分裝好用乳膠錐形瓶塞塞好錐形瓶，并用牛皮紙將瓶口包扎好。
3.2.2營養(yǎng)瓊脂的分裝
將配置好的營養(yǎng)瓊脂用500mL的錐形瓶裝進行分裝。分裝好用乳膠錐形瓶塞塞好錐形瓶，并用牛皮紙將瓶口包扎好。
3.2.3孟加拉紅瓊脂的分裝
將配置好的營養(yǎng)瓊脂用500mL的錐形瓶裝進行分裝。分裝好用乳膠錐形瓶塞塞好錐形瓶，并用牛皮紙將瓶口包扎好。
3.2.4乳糖膽鹽肉湯的分裝
將配置好的乳糖膽鹽用10mL的量管分裝在玻璃試管中，試管規(guī)格為15*150mm,錐形瓶裝進行分裝。分裝好用乳膠錐形瓶塞塞好錐形瓶，并用牛皮紙將瓶口包扎好。
3.3培養(yǎng)基和試劑滅菌
3.3.1培養(yǎng)基通常應采用高壓濕熱滅菌法，121℃滅菌15min,特殊培養(yǎng)基按使用者的特殊要求進行滅菌(如含糖培養(yǎng)基，115℃滅菌20min。)
3.3.2部分培養(yǎng)基(如嗜鹽瓊脂培養(yǎng)基，膽硫乳培養(yǎng)基等)，只能煮沸滅菌。
3.3.3對熱敏感的培養(yǎng)基或添加物質(zhì)，應采用膜過濾方法進行過濾除菌。
3.3.4即用型試劑不需滅菌，應參見相關國際標準或供應商使用說明，直接使用。
3.4試劑的殺菌
3.4.1生理鹽水的殺菌
將分裝完畢的生理鹽水，放在殺菌釜內(nèi)，擺放好。然后關上殺菌釜，打開電源，升溫到80℃時，打開放氣閥進行放氣，帶放氣閥門噴出大量水蒸氣時關上放氣閥。升溫至121℃開始計時，殺菌30min停止加熱，進行自然冷卻，待壓力回歸零時，打開放氣閥門進行放氣。等待條菌釜內(nèi)氣壓全部排凈完后打開殺菌釜，將生理鹽水取出送往微生物操作間的小窗內(nèi)。
3.4.2營養(yǎng)瓊脂的殺菌
將分裝完畢的營養(yǎng)瓊脂，放在殺菌釜內(nèi)，擺放好。然后關上殺菌釜，打開電源，升溫到80℃時，打開放氣閥進行放氣，帶放氣閥門噴出大量水蒸氣時關上放氣閥。升溫至121℃開始計時，殺菌30min停止加熱，進行自然冷卻，待壓力回歸零時，打開放氣閥門門進行放氣。等待殺菌釜內(nèi)氣壓全部排凈完后打開殺菌釜，將生理鹽水取出送往微生物操作間預處理間的水浴鍋，進行保溫，水浴鍋的溫度46土1℃。
3.5培養(yǎng)基的配制
3.5.1孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基的配制
稱取36g營養(yǎng)瓊脂用二次凈化水在250mL的燒杯中溶解后，轉(zhuǎn)移到1000mL的無色透明的容量瓶并用二次凈化水定容到1000mL。然后用250mL的錐形瓶分裝備用。
3.5.2乳糖膽鹽肉湯的配制
稱取36g營養(yǎng)瓊脂用二次凈化水在250mL的燒杯中溶解后，轉(zhuǎn)移到1000mL的無色透明的容量瓶并用二次凈化水定容到1000mL。然后用250mL的錐形瓶分裝備用。
3.6培養(yǎng)基的殺菌
3.6.1孟加拉紅瓊脂的殺菌
將分裝完畢的營養(yǎng)瓊脂，放在殺菌釜內(nèi)，擺放好。然后關上殺菌釜，打開電源,升溫到80℃時，打開放氣閥進行放氣，帶放氣閥門噴出大量水蒸氣時關上放氣閥。升溫至121℃開始計時，殺菌30min停止加熱，進行自然冷卻，待壓力回歸零時，打開放氣閥門進行放氣。等待殺菌釜內(nèi)氣壓全部排凈完后打開殺菌釜，將生理鹽水取出送往微生物操作間預處理間的水浴鍋，進行保溫，水浴鍋的溫度46℃士1℃。
3.6.2乳糖膽鹽肉湯的殺菌
將分裝完畢的乳糖膽鹽發(fā)酵管，放在殺菌釜內(nèi)，擺放好。然后關上殺菌金，打開電源，升溫到80℃時，打開放氣閥進行放氣，帶放氣閥門噴出大量水蒸氣時關上放氣閥。升溫至121℃開始計時，殺菌30min停止加熱，進行自然冷卻，待壓力回歸零時，打開放氣閥門進行放氣。等待殺菌釜內(nèi)氣壓全部排凈完后打開殺菌釜，將生理鹽水取出送往微生物操作間的小窗內(nèi)。
3.7培養(yǎng)皿和吸量管的殺菌
培養(yǎng)皿將培養(yǎng)基處理完，用84消毒液浸泡30min后，用洗潔精清洗干凈后用干燥箱烘干(160℃、30min)后，用牛皮包扎好，在160℃干熱殺菌2小時。1mL的吸量管也用84消毒液浸泡30min后，用洗潔精清洗干凈后用干燥箱烘干(160℃、30min)后，用牛皮紙包扎好，在160℃干熱殺菌2小時。
3.8器具和設備滅菌
3.8.1濕熱滅菌:采用高壓滅菌器，121℃滅菌20min,適用于玻璃器皿、移液器吸頭、塑料瓶等按照GB 15981的規(guī)定，評價高壓滅菌器的殺菌效果。
3.8.2干熱滅菌:采用干燥箱滅菌，160℃滅菌2h,180℃滅菌1h，適用于玻璃器皿，不銹鋼器具等。
3.8.3液體消毒劑消毒:使用適當濃度的自配或商業(yè)液體消毒劑對工作臺面、器具或設備表面進行消毒?？砂凑誈B 15981的規(guī)定，評價自配或商業(yè)消毒劑的消毒效果;可按照ISO 18593,監(jiān)測工作臺面、器具或設備表面的消毒效果。
3.9培養(yǎng)基常見問題
3.9.1培養(yǎng)基不能凝固的原因
制備過程中過度加熱；
低pH值造成培養(yǎng)基酸解；
稱量不正確；
瓊脂未完全溶解；
培養(yǎng)基成分未充分混勻。
3.9.2培養(yǎng)基pH值不正確的原因
制備過程中過度加熱;
水質(zhì)不佳;
外部化學物質(zhì)污染;
測定pH值時溫度不正確;
pH計未正確校準;
脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差。
3.9.3培養(yǎng)基產(chǎn)生沉淀的原因
制備過程中過度加熱;
水質(zhì)不佳;
脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差;
pH未正確控制。
3.9.4培養(yǎng)基顏色異常的原因
制備過程中過度加熱;
水質(zhì)不佳;
脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差;
pH不正確;
外來污染。
3.9.5培養(yǎng)基出現(xiàn)抑制重復性差
制備過程中過度加熱;
水質(zhì)不佳;
脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差;
使用成分不正確，如：成分稱量不準，添加物濃度不正確。
3.9.6培養(yǎng)基選擇性差的原因
制備過程中過度加熱;
脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差;
配方使用不對;
添加成分不正確，如加入添加成分時培養(yǎng)
基過熱或添加濃度錯誤。
四、微生物實驗操作
4.1實驗前準備
4.1.1無菌操作臺和微生物操作間殺菌消毒。
每次做實驗之前，用75%的酒精對無菌操作臺和微生物操作間進行噴灑消毒，然后開啟無菌操作臺上面的紫外燈對無菌操作臺殺菌30min以上。同時，開啟微生物操作間紫外燈對空氣殺菌消毒30min以上。
4.1.2微生物檢驗人員的工作服、帽、口罩和鞋子的殺菌。微生物檢驗人員的工作服、帽、口罩和鞋子在實驗之前，在微生物操作緩沖間用紫外燈殺菌30min以上。操作人員在進入微生物操作間時，先用香皂清洗手，然后用消毒好的毛巾擦干手，再用75%的酒精對手進行噴灑殺菌。
4.1.3營養(yǎng)瓊脂和孟加拉紅培養(yǎng)基外表面的殺菌。
營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在拿進微生物操作間時，先用75%的酒精噴酒消毒，因為錐形瓶外表面容易長菌，同時在打開錐形瓶塞是用酒精燈對瓶塞外表烤邊進行殺菌。微生物操作時，倒平板時，培養(yǎng)皿應該靠近酒精燈，同時每次對錐形瓶口烤下。
4.1.4乳糖膽鹽發(fā)酵口和樣品的口殺菌。
五、實驗室廢棄物處理
5.1對于培養(yǎng)物及其污染的物品(如斜面，用過的吸量管、細菌培養(yǎng)皿等)，應使用適當濃度的自配或商業(yè)液體消毒劑(參照D.1)對處理后一定時間，或121℃高壓滅菌至少30min,或者其他有效處理措施。將處理物倒入特殊標識的垃圾袋內(nèi)，直接送到指定地點。
5.2對于實驗動物尸體及相關廢棄物，按照GB 14925的規(guī)定進行處理。
5.3記錄并保留廢棄物和處理的記錄。
六、實驗結(jié)果報告
6.1菌落總數(shù)的計數(shù)
可用肉眼觀察，必要時用放大鏡，記錄稀釋倍數(shù)和相應的菌落數(shù)量。
選取南落數(shù)在30CF∪到300CFU之間、無基延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)，低于30CFU平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應采用兩個平板的平均數(shù)。
其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù):若狀菌落不到平板的一半，而其余一半菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。
6.2菌落總數(shù)的計算方法
若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數(shù)，作為每g(mL)樣品中菌落總數(shù)的結(jié)果。
若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，按公式計算。
若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)大于300CFU,則對稀釋度最高的平板進行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。
若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)小于30CFU,則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。
若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。
若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均不在30CFU300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU,則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。
6.3菌落總數(shù)的報告
菌落數(shù)小于100CFU時，按照“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報告。
菌落數(shù)大于或等于100CFU時，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約:取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù):也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。
若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù)，則報告菌落蔓延。
若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效。
6.4霉菌和醇母菌計數(shù)
可用肉眼觀察，必要時用放大鏡，記錄稀釋倍數(shù)和相應的菌落數(shù)量。
選取菌落數(shù)在10CFU到150CFU的平板、根據(jù)菌落形態(tài)分別計數(shù)霉菌和醉母數(shù)。霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為多不可數(shù)。菌落數(shù)應采用兩個平板的平均數(shù)。
6.5霉菌和醇母菌菌落總數(shù)的計算方法
計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應稀釋信數(shù)計算。
若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU則對稀釋度最高的平板進行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。
若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)小于10CFU,則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。
若所有稀釋度(包括液休樣品原液)平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算:如為原液，則以小于1計數(shù)。
6.6霉菌和酵母菌菌落總數(shù)的報告
菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字報告。
菌落數(shù)大于或等于100CFU時，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約:取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則可。采用兩位有效數(shù)字。
七、設備的校準、維護和性能驗證
7.1總則
7.1.1設備操作要求
實驗室負責人應確保每位操作人員均能按照說明書或設備操作指導書的要求進行操作。
7.1.2設備手冊
所有設備檔案應按照易于檢索的方式存檔。包括設備手冊，使用說明書、維修保養(yǎng)指南:購買時所附帶的全部技術資料以及采購、驗收的記錄。還應該搜集設備使用記錄、維修保養(yǎng)記錄等。
7.1.3設備記錄
7.1.3.1應詳細記錄與預期質(zhì)量控制結(jié)果不一致的情況，附上所采取的糾正措施，由負責分析的人員驗證并通知實驗室負責人。實驗室負責人應定期審核這些記錄。
7.1.3.2每臺對檢測質(zhì)量有影響的設備應有使用記錄本并放在設備附近。
7.1.3.3有關設備的每個事件都應記錄在案，包括日期、事件、采取的糾正措施、登記人的姓名等。
7.1.3.4應保存所有設備最近三年的使用記錄本和維護記錄本。
7.2設備的校準
應根據(jù)需要、設備類型和以往的性能情況和相應的法規(guī)要求確定校準頻率(見表C.1)
7.2.1設備校準要求和頻率
7.2.2設備性能驗證要求和頻率
7.2.3設備維護、清潔的要求和頻率
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