多形炭角菌（Xylaria polymorpha）屬于菌物界，子囊菌門，盤菌亞門，糞殼菌綱，炭角菌亞綱，炭角菌目，炭角菌科，炭角菌屬。多形炭角菌主要生長于林間腐木、樹皮裂縫中。研究表明，多形炭角菌具有藥用價值，是天然產(chǎn)物的豐富來源。JANG等不僅從多形炭角菌子實體的甲醇提取物分離到亞油酸、亞油酸甲酯及麥角甾醇等多種生物活性物質(zhì)，還分離到2種聚丙酸酯xylarinic acids A和B（具有清除自由基、抗真菌與抗炎活性）。楊寧寧等從多形炭角菌菌絲發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯部分中分離鑒定出具有乙酰膽堿酯酶及α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗線蟲活性的新物質(zhì)。由于多形炭角菌的資源比較匱乏，難以大量收集，其大規(guī)模開發(fā)利用受到限制。


筆者對一株疑似炭角菌屬的大型野生真菌進(jìn)行組織分離，并通過真核生物核糖體基因ITS序列對其進(jìn)行鑒定并研究其培養(yǎng)特性，為其人工馴化栽培及產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)。


1材料與方法


1.1供試材料


供試菌株采自英國諾里奇東安吉利亞大學(xué)校區(qū)林間的野生大型真菌（圖1），保存于長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室。


供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨2.0 g，磷酸二氫鉀3.0 g，硫酸鎂1.5 g，去離子水1000 mL，pH自然。


1.2試驗方法


1.2.1菌株的分離純化


將野生菌進(jìn)行酒精消毒后，取子實體部分接于PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫箱中培養(yǎng)，4 d后挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接2～3次，經(jīng)鏡檢無雜菌后即得到純化的菌株，編號為T-18。


1.2.2形態(tài)學(xué)鑒定


將菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，7 d后觀察記錄菌落特征、菌絲形態(tài)。


1.2.3分子系統(tǒng)鑒定


將菌絲置于PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，離心取出菌絲后采用改良的CTAB法提取DNA。PCR擴(kuò)增引物：ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，PCR反應(yīng)體系（50μL），其體系為10×Taq Buffer 5μL，dNTPs（2 mmol/L）5μL，Taq（2 U/μL）1μL，上下游引物各1μL（10μmol/L），ddH2O 33μL，DNA模板4μL。PCR擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。0.8%的瓊脂凝膠電泳檢測后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。


1.2.4菌絲生長特性研究


保存的菌種接種到PDA培養(yǎng)基上，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d進(jìn)行活化。取1 cm2左右活化菌種接種進(jìn)裝有150 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中，放置于25℃、轉(zhuǎn)速為100 r/min的溫控?fù)u床培養(yǎng)5 d，制成種子液備用。


1.2.4.1碳源對菌絲體生長的影響


以不加葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對照，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖的含碳量為標(biāo)準(zhǔn)，以相同含碳量的蔗糖、乳糖、麥芽糖、α-可溶性淀粉分別代替葡萄糖，共6個處理，每個處理3次重復(fù)。培養(yǎng)基裝液量50 mL/100 mL三角瓶，等量接種，放置于25℃、轉(zhuǎn)速為100 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，取發(fā)酵液過濾，收集菌絲體。菌絲體于50℃烘干12 h至恒重后稱重。計算菌絲體產(chǎn)量（平均每100 mL發(fā)酵液得到的菌絲體干重）。


1.2.4.2氮源對菌絲體生長的影響


以不加蛋白胨的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對照，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蛋白胨的含氮量為標(biāo)準(zhǔn)，以相同含氮量的牛肉膏、酵母粉、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉分別代替蛋白胨，研究氮源對菌絲體生長的影響。共7個處理，每個處理3次重復(fù)。其他步驟同1.2.4.1。


1.2.4.3無機(jī)鹽對菌絲體生長的影響


以不加磷酸二氫鉀和硫酸鎂的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對照，選用硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硫酸鉀6種無機(jī)鹽進(jìn)行試驗。其他步驟同1.2.4.1。


1.2.4.4溫度對菌絲體生長的影響


液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為15、20、25、30、35℃，共6個處理，每個處理3次重復(fù)。其他步驟同1.2.4.1。


1.2.4.5 pH對菌絲體生長的影響


液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH設(shè)置為3、4、5、6、7、8、9，每個處理3次重復(fù)。其他步驟同1.2.4.1。


1.2.5數(shù)據(jù)處理


以菌絲體生物量作為指標(biāo)，繪制柱狀圖。采用SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用LSD法比較各因素對菌絲產(chǎn)量的差異顯著性影響。

圖1樣品子實體形態(tài)

圖2樣品菌落平板形態(tài)

圖3 ITS片段PCR產(chǎn)物電泳圖


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