摘要：[目的]高溫堆積發(fā)酵是醬香型白酒生產(chǎn)中的關(guān)鍵工藝環(huán)節(jié)，克羅彭斯特德菌屬(Kroppenstedtia)是堆積酒醅中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，研究其生長(zhǎng)和代謝特征對(duì)于理解堆積發(fā)酵的關(guān)鍵作用至關(guān)重要。
[方法]采用胰酪大豆蛋白胨(tryptic soy broth,TSB)培養(yǎng)基從酒醅中篩選克羅彭斯特德菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)和16S rRNA基因測(cè)序確定其分類學(xué)地位，結(jié)合菌株純培養(yǎng)及不同溫度(45℃和50℃)下的高粱固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究其生長(zhǎng)和揮發(fā)性化合物代謝特征。
[結(jié)果]從醬香型白酒堆積酒醅中分離篩選到3株克羅彭斯特德菌，經(jīng)鑒定為象牙色克羅彭斯特德菌(Kroppenstedtia eburnea)。液態(tài)培養(yǎng)時(shí)菌株K.eburnea 1613促進(jìn)吡嗪類物質(zhì)的產(chǎn)生，為對(duì)照的2.66倍。在固態(tài)發(fā)酵高粱中檢出的揮發(fā)性化合物主要為醇類和酸類，總含量隨發(fā)酵時(shí)間的推移而逐漸增加。50℃發(fā)酵高粱有利于醇類、酸類和吡嗪類物質(zhì)的積累，而45℃下酯類物質(zhì)含量較高。3株菌以高粱為基質(zhì)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵時(shí)主要代謝產(chǎn)物是苯乙醇和異戊酸，其中K.eburnea 1615在50℃下發(fā)酵15 d時(shí)苯乙醇和異戊酸含量最高，為(31.17±0.14)μg/g和(16.75±0.76)μg/g。菌株K.eburnea 6E22在50℃下發(fā)酵15 d時(shí)2,5-二甲基吡嗪含量最高，為(1.67±0.14)μg/g。菌株K.eburnea 1613在發(fā)酵15 d時(shí)己酸含量最高，為(3.74±0.19)μg/g。50℃下發(fā)酵高粱自身中醛酮類物質(zhì)積累明顯。偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)顯示，溫度和時(shí)間對(duì)3株菌發(fā)酵高粱中揮發(fā)性化合物的組成有顯著影響。
[結(jié)論]象牙色克羅彭斯特德菌有助于堆積發(fā)酵酒醅風(fēng)味化合物的產(chǎn)生，特別是醇類、酸類和吡嗪類等醬香型白酒特征風(fēng)味物質(zhì)。
醬香型白酒以其香氣幽雅細(xì)膩、酒體醇厚豐滿著稱，其生產(chǎn)工藝特點(diǎn)是“四高兩長(zhǎng)，一大一多”，即高溫堆積，高溫餾酒，高溫發(fā)酵，高溫制曲；生產(chǎn)周期長(zhǎng)，儲(chǔ)酒時(shí)間長(zhǎng)；用曲量大，多輪次取酒。高溫堆積發(fā)酵是醬香型白酒生產(chǎn)的關(guān)鍵工序，被稱為是“二次制曲”過(guò)程，主要起到網(wǎng)羅環(huán)境中的微生物、生成重要醬香風(fēng)味化合物或前體物質(zhì)以及糖化發(fā)酵作用。
克羅彭斯特德菌屬(Kroppenstedtia)是醬香型白酒大曲生產(chǎn)和酒醅堆積發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，相對(duì)豐度約為3.49%?41.73%。克羅彭斯特德菌屬屬于芽孢桿菌綱(Bacilli)的高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae)，基于EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ezbiocloud.net/identify)，目前該屬有4個(gè)分類學(xué)地位明確的種，包括象牙色克羅彭斯特德菌(K.eburnea)、廣州克羅彭斯特德菌(K.guangzhouensis)、肺克羅彭斯特德菌(K.pulmonis)和血克羅彭斯特德菌(K.sanguinis)，主要是從塑料表面、血液、土壤和腦脊液分離出來(lái)的，均為好氧耐熱微生物，其中K.guangzhouensis最適生長(zhǎng)溫度為50℃，其余均為45℃。溫度是影響醬香型白酒堆積發(fā)酵質(zhì)量的重要因素，能反映堆積發(fā)酵過(guò)程是否正常，在堆積過(guò)程酒醅溫度最高能達(dá)到50℃左右。
目前基于宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，克羅彭斯特德菌屬是醬香型白酒釀造過(guò)程脂肪酸生物合成的功能微生物。對(duì)6個(gè)輪次大曲酶編碼基因進(jìn)行功能注釋發(fā)現(xiàn)，象牙色克羅彭斯特德菌編碼α-淀粉酶，能參與大曲發(fā)酵過(guò)程的碳水化合物代謝。此外，斯皮爾曼相關(guān)性分析顯示，在大曲發(fā)酵過(guò)程中克羅彭斯特德菌屬與氨基酸、乙酸等風(fēng)味物質(zhì)呈顯著正相關(guān)。然而，克羅彭斯特德菌屬在菌株水平的代謝特性及其在醬香型白酒堆積過(guò)程中對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)尚不清楚。
因此，本研究采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)手段從醬香型白酒堆積酒醅中分離、篩選克羅彭斯特德菌，結(jié)合冷場(chǎng)掃描電鏡及測(cè)序手段鑒定其形態(tài)特征和分類學(xué)地位；在純培養(yǎng)條件下研究菌株的生長(zhǎng)和揮發(fā)性化合物代謝情況；最后，以醬香型白酒釀造原料紅纓子高粱為基質(zhì)進(jìn)行15 d恒溫固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，探究克羅彭斯特德菌在不同溫度(45℃和50℃)條件下?lián)]發(fā)性化合物的產(chǎn)生情況。
1、材料與方法
1.1材料
1.1.1樣品采集
本研究中所用的酒醅樣品取自某醬香型白酒酒廠，分別取自醬香型白酒第三次堆積發(fā)酵的第1、4、9天的酒醅。每一個(gè)酒醅樣品取自距離地面50 cm的堆積酒醅，取樣深度為20 cm，三點(diǎn)取樣，每個(gè)點(diǎn)取約50 g酒醅，混勻后放入無(wú)菌自封袋。放冰袋4℃保存，送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)微生物分離。
1.1.2主要試劑和儀器
叔戊醇(色譜級(jí)純度)，Sigma-Aldrich公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；胰酪大豆蛋白胨(tryptic soy broth,TSB)培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；定量PCR儀，ThermoFisher Scientific公司；Spark多模微孔板閱讀器，Tecan公司；冷場(chǎng)掃描電鏡，HITACHI公司。
1.1.3培養(yǎng)基
調(diào)研克羅彭斯特德菌屬相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，常用TSB培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基。
TSB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨17.0，氯化鈉5.0，大豆蛋白胨3.0，磷酸氫二鉀2.5，葡萄糖2.5。固體培養(yǎng)基需添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的瓊脂粉。滅菌條件為115℃、20 min。
固態(tài)發(fā)酵高粱培養(yǎng)基：向250 mL錐形瓶中加入100 g紅纓子高粱和80 mL去離子水，121℃滅菌30 min后，冷卻至50℃?zhèn)溆谩?
1.2酒醅中微生物的分離篩選及鑒定
稱取10 g堆積醅樣品，添加到裝有100 mL無(wú)菌生理鹽水和適量玻璃珠的250 mL三角瓶?jī)?nèi)，45℃、180 r/min振蕩30 min，靜置10 min，待酒醅沉到瓶底后，獲得菌懸液。取上清液進(jìn)行梯度稀釋(10?1?10?7)，取100μL菌懸液涂布在TSB固體培養(yǎng)基上，放置在45℃培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)2?3 d。待菌落長(zhǎng)出后，每隔一段時(shí)間挑選不同菌落形態(tài)的單菌落，分離純化3次后接種到TSB液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上45℃、180 r/min培養(yǎng)2 d。取2 mL菌液，根據(jù)細(xì)菌DNA快速提取試劑盒的說(shuō)明書，提取菌株DNA用于物種鑒定，同時(shí)取0.9 mL菌液轉(zhuǎn)移到有0.9 mL 50%甘油的保種管里，置于?80℃冰箱保藏備用。
參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》的方法對(duì)克羅彭斯特德菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。分子生物學(xué)鑒定以細(xì)菌的16S rRNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對(duì)提取的菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25μL)：DNA模板1μL，2×Taq Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)12.5μL，上、下游引物(10μmol/L)各1μL，加無(wú)菌ddH2O至25μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性7 min；95℃變性25 s，56℃退火30 s，72℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物送至天霖生物科技無(wú)錫有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中的模式菌株進(jìn)行同源比對(duì)。利用MEGA 7軟件基于鄰近法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以暹羅芽孢桿菌(Bacillus siamensis)KCTC 13613T的16S rRNA基因作為外源菌序列。
1.3菌株生長(zhǎng)代謝特性
1.3.1生長(zhǎng)曲線測(cè)定
將菌株在固體TSB培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，挑選單菌落在液體TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得生長(zhǎng)活力良好的種子液。以1%接種量轉(zhuǎn)接到加有適量玻璃珠的裝有100 mL TSB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，每隔4 h采集發(fā)酵液用于分析生長(zhǎng)和代謝特征，以未接種的培養(yǎng)基為對(duì)照，每組設(shè)置3個(gè)平行。
吸取200μL發(fā)酵液至96孔板中，使用酶標(biāo)儀測(cè)量600 nm處OD值。采用微量pH計(jì)(METTLER TOLEDO公司)測(cè)定pH值。將傳代3次的生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600約為2.0)的菌液涂布在平板上，讓菌長(zhǎng)滿整個(gè)平板。挑取菌體，用PBS緩沖液清洗3次，再用2.5%的戊二醛溶液固定2次，用冷場(chǎng)掃描電子顯微鏡觀察菌體的微觀形態(tài)。
1.3.2揮發(fā)性化合物測(cè)定
采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)測(cè)定菌液中揮發(fā)性化合物組成。取30 mL培養(yǎng)至平穩(wěn)期的菌液于50 mL離心管中，4℃、8 000 r/min離心10 min。取5 mL上清液于20 mL頂空瓶中，加入2.3 g氯化鈉以及10μL 8.05 g/L的色譜級(jí)叔戊醇內(nèi)標(biāo)液。
檢測(cè)條件：色譜柱為DB-Wax毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25μm)，載氣為He，流速為1 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250℃，解吸5 min，不分流進(jìn)樣；氣相升溫程序：初始溫度40℃，保持3 min，以5℃/min升至60℃，再以10℃/min升至230℃，保持8 min。質(zhì)譜條件：離子源溫度260℃，界面溫度200℃，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍25–350 amu。采用NIST17譜庫(kù)進(jìn)行定性分析，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各種物質(zhì)的相對(duì)含量。
1.4菌株固態(tài)發(fā)酵高粱的產(chǎn)香特征分析
1.4.1不同溫度條件下固態(tài)發(fā)酵高粱
菌株按1%的接種量接種于TSB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至平穩(wěn)期，4℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體，利用PBS緩沖液洗滌菌體2次并重懸。向固態(tài)發(fā)酵高粱培養(yǎng)基中分別加入20 mL菌株重懸液，混勻后分別放入45℃和50℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以加入20 mL無(wú)菌水為空白對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。在發(fā)酵第0、4、7和15 d時(shí)分別取樣，置于?80℃冰箱備用。
1.4.2菌株固態(tài)發(fā)酵高粱的揮發(fā)性化合物測(cè)定
采用HS-SPME-GC-MS檢測(cè)菌株在不同溫度條件下發(fā)酵高粱的揮發(fā)性化合物組成。取5 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL超純水，充分渦旋振蕩混勻，4℃超聲處理30 min，8 000 r/min離心10 min。取5 mL上清液至20 mL頂空瓶中，加入2.3 g氯化鈉以及10μL 8.05 g/L的色譜級(jí)叔戊醇內(nèi)標(biāo)液。HS-SPME-GC-MS運(yùn)行程序與分析方法見(jiàn)1.3.2。
1.5數(shù)據(jù)分析
利用Microsoft Excel 2016、Origin 2021等軟件對(duì)獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用SIMCA 14.1軟件對(duì)揮發(fā)性化合物進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，利用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，使用派森諾云平臺(tái)(https://www.genescloud.cn/login)進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)聚類熱圖繪制，對(duì)每個(gè)揮發(fā)性化合物分別采用Z-score方法標(biāo)準(zhǔn)化。
醬香型白酒堆積酒醅中分離克羅彭斯特德菌生長(zhǎng)和揮發(fā)性化合物代謝特征（一）
醬香型白酒堆積酒醅中分離克羅彭斯特德菌生長(zhǎng)和揮發(fā)性化合物代謝特征（二）
醬香型白酒堆積酒醅中分離克羅彭斯特德菌生長(zhǎng)和揮發(fā)性化合物代謝特征（三）
相關(guān)新聞推薦
1、?土壤生態(tài)系統(tǒng)的命運(yùn)共同體：從蚯蚓到微生物的共生網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)
2、高產(chǎn)果膠酶青霉菌株生長(zhǎng)曲線及分類鑒定（一）
3、口腔微生物組：胰腺癌風(fēng)險(xiǎn)的新型生物標(biāo)志物