反芻動(dòng)物瘤胃微生物對(duì)飼料消化能力起決定性作用，介于對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)素供應(yīng)影響其泌乳性能和飼料效率。牛月形單胞菌(Selenomonas bovis)作為高飼料轉(zhuǎn)化效率奶牛瘤胃中的基石微生物，可主導(dǎo)更高效的碳水化合物底物利用與代謝功能活性，是高效奶牛瘤胃菌群和功能調(diào)控的重要靶點(diǎn)微生物。牛月形單胞菌是月形單胞菌屬的一種，是參與瘤胃發(fā)酵的重要細(xì)菌。其對(duì)反芻動(dòng)物的生糖以及丙酸的生成起重要作用。利用多種宏組學(xué)聯(lián)用技術(shù)系統(tǒng)研究，揭示了不同互作機(jī)制下的瘤胃微生態(tài)對(duì)奶牛飼料轉(zhuǎn)化效率的影響；發(fā)現(xiàn)在高效動(dòng)物瘤胃中，牛月形單胞菌的豐度上調(diào)4倍，并主導(dǎo)了幾個(gè)產(chǎn)琥珀酸細(xì)菌的正向互作。此外，遺傳學(xué)特性分析發(fā)現(xiàn)牛月形單胞菌為具有中等遺傳力(遺傳力為0.31)的可遺傳瘤胃細(xì)菌，因其穩(wěn)定的代際遺傳特性而具有重要調(diào)控潛力，提示靶向調(diào)控瘤胃微生物牛月形單胞菌的豐度和功能可為精準(zhǔn)調(diào)控反芻動(dòng)物飼料轉(zhuǎn)化效率提供新的可能。因此，分離篩選瘤胃丙酸生成菌-牛月形單胞菌對(duì)研究反芻動(dòng)物瘤胃微生物丙酸代謝和調(diào)控提供理論基礎(chǔ)，對(duì)牛月形單胞菌進(jìn)行體外分離培養(yǎng)具有重要科學(xué)和生產(chǎn)意義。
下面提供一種牛月形單胞菌分離培養(yǎng)方法，成功從奶牛瘤胃液中分離出牛月形單胞菌，該牛月形單胞菌可調(diào)節(jié)碳水化合物的趨化性，是高效奶牛瘤胃菌群和功能調(diào)控的重要靶點(diǎn)微生物。
一種牛月形單胞菌分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
步驟1、基于瘤胃插管技術(shù)進(jìn)行瘤胃液采集：采樣當(dāng)天于晨飼前(04：00-06：00)采用口腔插管法采集奶牛瘤胃內(nèi)容物，采集的瘤胃內(nèi)容物用4層濾網(wǎng)(180目)進(jìn)行過濾得到瘤胃液，然后將瘤胃液裝入螺旋離心管中，并迅速向其中通入CO2；
步驟2、培養(yǎng)前的材料制備與準(zhǔn)備工作：材料準(zhǔn)備包括專性厭氧桿菌營(yíng)養(yǎng)液、LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、PYG培養(yǎng)基、維生素K1、血紅素、馬血清、二柳蘇糖醇(DTT)、基本培養(yǎng)基MM、PMD18-T載體、感受態(tài)細(xì)胞、細(xì)菌基因組DNA小量制備試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、日常型質(zhì)粒DNA小劑量純化試劑盒、PCR擴(kuò)增用材料：包括生化反應(yīng)管(31種)、Taq DNA聚合酶、dNTPs Mix-ture、5mg/ml EB、rTaq DNA聚合酶(5U/μL)、DNAMarker DL 2000、DNAMarker DL15000、dNTPs(2.5mmol/L)、Biospin膠回收試劑盒；
步驟3、牛月形單胞菌的分離；
將瘤胃液于37℃迅速送回實(shí)驗(yàn)室在600r/min下離心10min，以去除瘤胃液中的飼料顆粒及纖毛蟲等微生物，取上清液，用生理鹽水梯度稀釋，然后各取50μL不同梯度的稀釋液用L棒均勻涂布于固體培養(yǎng)基中，在厭氧工作站或用厭氧培養(yǎng)袋在39℃條件下培養(yǎng)48h，取單個(gè)40μL菌落在新鮮LB固體培養(yǎng)基上劃線，純培養(yǎng)，并進(jìn)行專性厭氧桿菌營(yíng)養(yǎng)液的液體培養(yǎng)，在厭氧工作站中在37℃下恒溫培養(yǎng)48h，再進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢；
稱取PYG培養(yǎng)基基礎(chǔ)18.04g，加熱溶解于500mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min后，冷卻至50℃，加入過濾除菌的維生素K1溶液0.5mL、血紅素溶液(5mg/mL)2.5mL，以及25mL滅菌瘤胃液、25mL馬血清和0.1gDTT，使用8M NaOH將pH值調(diào)整至7.2，混勻備用；菌株保藏，將單個(gè)菌落接種于新鮮的液體全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，在厭氧培養(yǎng)箱(85％氮?dú)狻?0％二氧化碳和5％氫氣)中過夜，然后取菌液加入到滅菌甘油(濃度15％-20％)中，使用厭氧培養(yǎng)箱于37℃條件下培養(yǎng)48h，接著無菌條件下加入2mL細(xì)菌懸液至營(yíng)養(yǎng)肉湯中，將細(xì)菌和肉湯混勻使細(xì)菌最終濃度為108-109cell/mL；基于凍干法在無菌條件下將細(xì)菌分裝到有滅菌玻璃珠的冷凍管中，反復(fù)吹打，使珠子內(nèi)部的氣泡完全被細(xì)菌懸液替代，吸去冷凍管內(nèi)多余的液體，將混有細(xì)菌和珠子的冷凍管放入-80℃冰箱保存。
步驟4、利用常規(guī)細(xì)菌接種法進(jìn)行生化試驗(yàn)：將活化至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的菌株以2％(v/v)的接種量接種于基本培養(yǎng)基MM中，分別以0.5％多糖(淀粉、葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、菊粉、地衣多糖、木葡聚糖)、0.5％二糖(纖維二糖、木二糖、甘露二糖)或0.5％單糖(葡萄糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖)作為唯一碳源底物，置于厭氧培養(yǎng)箱中于37℃條件下培養(yǎng)；利用Bioscreen全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀連續(xù)測(cè)定80h，且每4h進(jìn)行一次OD600值測(cè)定，繪制可代謝碳源底物譜和生長(zhǎng)曲線，試驗(yàn)重復(fù)3次；生長(zhǎng)曲線如圖1所示，從圖中可以看出，以淀粉、木聚糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖或半乳糖作為可代謝底物時(shí)有利于菌株生長(zhǎng)。
毛細(xì)管趨化試驗(yàn)具體步驟為：
挑取單菌落培養(yǎng)至OD600為0.1-0.2，將菌株使用趨化緩沖液(50mM磷酸鉀緩沖液添加到20μM EDTA、0.05％甘油中，pH7.0)洗滌2次，在1200g下低速離心3min后，用相同緩沖液稀釋至OD600為0.05，然后將細(xì)菌懸液分裝于96孔板；使用趨化緩沖液配制不同濃度的效應(yīng)物分子-可代謝碳源底物，將毛細(xì)管一端熱封，填充趨化緩沖液以及加入碳源底物效應(yīng)物的趨化緩沖液，毛細(xì)管開放段浸于細(xì)菌懸液中，趨化30min后，將毛細(xì)管從細(xì)菌懸液取出，用ddH2O沖洗表面，內(nèi)容物全部吹打并涂布于LB瓊脂平板，37℃條件下厭氧培養(yǎng)24h，記錄菌落形成單位(CFU)，減去空白趨化緩沖液的毛細(xì)管細(xì)菌數(shù)進(jìn)行校正，得到趨化細(xì)菌數(shù)目，并計(jì)算趨化性指數(shù)。
結(jié)果如圖2所示，以淀粉、木聚糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖或半乳糖作為可代謝底物時(shí)，趨化性指數(shù)均大于1，說明牛月形單胞菌對(duì)淀粉、木聚糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖或半乳糖可代謝底物產(chǎn)生正向趨化。
軟瓊脂平板趨化試驗(yàn)具體步驟為：
將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液(OD600為0.5-0.7)，使用趨化緩沖液洗滌3次，在1200g下低速離心3min后，將10μL濃度為100μM的碳源底物效應(yīng)物點(diǎn)板于含0.25％(w/v)瓊脂的固體MSB中，4℃過夜；在趨化平板中央效應(yīng)物原點(diǎn)兩側(cè)等距離接種菌液1μL，共接種2個(gè)點(diǎn)，然后將趨化平板在30℃下培養(yǎng)20-30h后拍照。
結(jié)果如圖3所示，以淀粉、木聚糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖或半乳糖作為可代謝底物時(shí)形成了明顯的趨化圈，說明牛月形單胞菌可調(diào)節(jié)碳水化合物的趨化性。
步驟5、菌株16S rDNA基因序列鑒定：用細(xì)菌基因組DNA小量制備試劑盒提取牛月形單胞菌DNA并以其為擴(kuò)增模板，退火溫度為50℃，35個(gè)循環(huán)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳觀察結(jié)果；用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收特異DNA片段的PCR產(chǎn)物，將其連接在PMD18-T載體上，16℃連接過夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DN5α株感受態(tài)細(xì)胞中，搖菌1h后將菌液涂在Amp+的LB瓊脂平板上37℃恒溫振蕩培養(yǎng)12-16h；用日常型質(zhì)粒DNA小劑量純化試劑盒提取重組質(zhì)粒，電泳觀察提取結(jié)果；PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒，電泳觀察并送TaKaPa公司對(duì)其測(cè)定序列，由DNAsis軟件分析測(cè)序結(jié)果；設(shè)計(jì)細(xì)菌16S rRNA基因片段PCR擴(kuò)增通用引物，上游引物序列為：5′AGAGTTTGATC(A/C)TGG3′，下游引物序列為：5′GGACTAC(A/T/C)AGGGTATCTAAT 3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；提取分離菌株的基因組DNA擴(kuò)增其16SrDNA基因片段與GenBank中發(fā)表的牛月形單胞菌16S rRNA進(jìn)行基因序列同源性分析，同源性為97％，確定分離菌株為牛月形單胞菌。
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