圖4 DLD-1細胞線粒體呼吸變化
(A)SPP(0、0.8、1.6、2.4、3.2 mg/mL)處理后細胞OCR的總體曲線；(B)SPP處理后細胞的基礎呼吸；(C)SPP處理對細胞A-TP產生的影響；(D)對照組和SPP預處理細胞的最大呼吸量；(E)對照組和SPP預處理細胞的呼吸變化
**與對照組相比P<0.01
隨著SPP濃度的增加，DLD-1細胞的呼吸作用和輔助呼吸作用逐漸減弱(P<0.01)。與對照組相比，spp處理后細胞的最大呼吸分別降低了56.81%、87.27%、154.69%和170.70%(圖4D)，輔助呼吸分別降低了34.15%、47.89%、88.92%和109.40%(圖4E)。這說明SPP在很大程度上抑制了細胞線粒體能量代謝過程。
Warburg等發(fā)現腫瘤細胞在生長過程中通過切換代謝途徑來適應缺氧環(huán)境，腫瘤細胞糖酵解速率增加就是證明，即使在回到常氧條件后，腫瘤細胞仍繼續(xù)依賴糖酵解來產生能量。這個代謝過程被定義為好氧糖酵解。生物能量分析儀能夠研究細胞的耗氧速率，可應用于細胞糖酵解的研究。本研究采用Bioenergy Analyzer測定SPP處理后細胞糖酵解的變化，探討SPP對細胞糖酵解的影響。
隨著SPP濃度的增加，細胞糖酵解過程明顯受到抑制，細胞外酸化率(ECAR)整體水平明顯降低(圖5A-B)，表現為基礎糖酵解逐漸降低速率，細胞糖代謝速率，最大糖酵解速率和剩余糖酵解能力。與對照組相比，SPP處理組的基礎糖酵解率分別降低4.58%、5.70%、7.68%、8.01%(圖5C)，細胞糖代謝率分別降低20.19%、30.37%、39.21%、72.72%(圖5D)，最大糖酵解分別降低26.16%、38.40%、40.79%、62.46%(圖5E)，備用糖酵解能力分別降低20.11%、28.17%、63.50%、68.77%(圖5F)，差異均有統計學意義(P<0.01)。以上結果表明，SPP可顯著降低細胞糖酵解水平。
圖5 DLD-1細胞有氧糖酵解調節(jié)的變化
(A)SPP預處理細胞整體ECAR曲線；(B)A放大46.5-73.0 min；(C)對照和SPP預處理細胞的基礎糖酵解率；(D)SPP處理前后DLD-1細胞糖酵解轉化能力；(E)對照組和SPP預處理后DLD-1細胞最大糖酵解速率；(F)SPP處理后DLD-1細胞剩余糖酵解能力的改變
**與對照組相比P<0.01
4結論
結直腸癌是全球第三大常見惡性腫瘤，發(fā)病率最高(10.2%)，其發(fā)病率和死亡率在發(fā)達國家和經濟轉型國家之間差異很大。根據美國癌癥研究所(AICR)和世衛(wèi)組織國際癌癥研究機構(IARC)發(fā)布的最新數據，結直腸癌是男性第三大常見癌癥，女性第二大常見癌癥，2018年全球新發(fā)病例超過180萬例，預計到2030年全球結直腸癌負擔將增加60%。癌癥治療后，如化療、手術和放射治療，普遍存在潛在的或嚴重的毒副作用。因此，迫切需要開發(fā)新型有效、無毒的抗腫瘤藥物。近年來，天然藥物在癌癥治療中發(fā)揮著重要作用。各種具有抗腫瘤活性的蛋白質或多肽已被研究用于與化療藥物的聯合抗腫瘤作用。與抗癌藥物相比，具有生物活性的蛋白質或多肽是首選，因為它們沒有致畸作用，沒有累積毒性，不容易導致耐藥。在本研究中，一定濃度的SPP可顯著抑制DLD-1細胞的生長和增殖，并呈劑量依賴性。
細胞凋亡是一種程序性的細胞死亡，是正常生物清除衰老和不功能細胞，維持正常細胞代謝平衡的防御機制，在細胞的多種功能中發(fā)揮重要作用。細胞凋亡的典型形態(tài)特征有:凋亡啟動后細胞形態(tài)呈圓形，隨后細胞黏附消失，細胞間連接斷開，細胞質濃縮，核染色質濃縮高密度，核裂解，核內出現典型的空泡結構，核膜復雜，凋亡小體晚期分裂為多個凋亡細胞。細胞凋亡除了作為正常生理過程發(fā)生外，體外環(huán)境因素也可誘導細胞凋亡。細胞凋亡在包括癌癥在內的許多疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，細胞內線粒體的這種調節(jié)功能的關閉導致細胞凋亡不足和細胞過度增殖。
當細胞凋亡被阻斷，導致平衡被破壞時，這反過來為腫瘤的形成奠定了基礎。結果表明，SPP可誘導結腸癌DLD-1細胞凋亡，促進細胞死亡。腫瘤細胞的快速增殖將耦合對能量的更大需求，因此，針對腫瘤的生物能量代謝已成為癌癥治療的一種新的有效預防途徑，高效完整地研究分子或藥物對腫瘤細胞能量代謝的影響已成為主要問題。生物能量分析儀采用固態(tài)探針和獲得專利的瞬時微室技術，實時、靈敏、準確、無損地檢測細胞能量代謝狀態(tài)，可以同時測量細胞中兩種主要的能量代謝途徑——線粒體呼吸和糖酵解。細胞能量代謝的主要指標，如基礎呼吸、ATP生成、最大呼吸、基礎糖酵解速率、最大糖酵解速率、備用糖酵解能力等，為細胞能量代謝的測定提供了一種新的、方便、快速的方法。
在本研究中，SPP對基礎呼吸、最大呼吸、儲備呼吸和ATP轉換表現出劑量依賴的抑制作用，但劑量效應關系可能是非線性的。這種下降可能是由于SPP處理細胞的凋亡狀態(tài)和活性氧(ROS)水平的增加可能引起細胞的氧化損傷，進而降低線粒體呼吸鏈復合物的活性，影響線粒體ATP合成能力，高劑量(3.2 mg/mL)SPP對細胞線粒體有氧/氧化活性的影響。這可能與線粒體能量代謝紊亂直接相關，具體機制有待進一步研究。糖酵解能在缺氧條件下迅速為細胞提供能量。結果表明，SPP可降低DLD-1細胞的糖酵解，影響其糖酵解功能，但損害程度低于基礎耗氧率和有氧呼吸最大值的降低，提示SPP對細胞能量代謝的主要影響是由于線粒體功能的損害。
綜上所述，本文主要研究了不同劑量SPP對人結腸癌DLD-1細胞能量代謝的影響。其作用機制可能與抑制細胞增殖、促進細胞凋亡有關。海馬XFe24細胞能量代謝分析儀可靈敏檢測基礎有氧呼吸速率、ATP耦合有氧呼吸速率等指標的變化。為SPP誘導腫瘤細胞壞死提供了可行性，但能否應用于臨床治療尚需進一步探索。
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