棒桿菌屬細菌由于具有生物安全(美國FDA認證)、生長速度快、營養(yǎng)需求低、底物譜廣等優(yōu)勢，被認為是生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的理想工業(yè)底盤菌株，廣泛應用于氨基酸和有機酸等化學品的工業(yè)化生產(chǎn)，尤其是在賴氨酸、谷氨酸等氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)中占據(jù)主導地位。多年來現(xiàn)有技術對棒桿菌屬菌株進行了大量的研究和遺傳改造，包括氨基酸合成途徑、底物利用途徑、增強氨基酸外排等的改造，已經(jīng)獲得了較高水平的產(chǎn)氨基酸的棒桿菌屬工程菌株。目前，多種氨基酸的工業(yè)發(fā)酵水平超過100g/L，賴氨酸的工業(yè)發(fā)酵水平超過200g/L(Xu,J.Z.,et al.,Microb Cell Fact,2020,19,39；戶紅通等,中國釀造,2018,37(10),51-56)。
然而，在發(fā)酵過程中，高濃度賴氨酸、谷氨酸等發(fā)酵產(chǎn)物的積累以及底物的不斷流加均對棒桿菌細胞造成極高的滲透壓，高滲透壓也幾乎是所有高水平工業(yè)菌株在發(fā)酵后期都會面臨的環(huán)境脅迫(Varela C et al.Applied Microbiology And Biotechnology2003,60(5):547-555)，直接影響細胞的膨脹度、完整性、水合程度和分子擁擠程度等，從而干擾細胞的生長代謝，成為影響終產(chǎn)物合成效率的關鍵因素，限制了工業(yè)菌株發(fā)酵水平的進一步提升。增強棒桿菌屬菌株對高滲透壓的耐受能力，是提高發(fā)酵產(chǎn)物終濃度，提升生物發(fā)酵經(jīng)濟性的有效手段。但是，現(xiàn)有技術中，由于缺乏高通量的功能基因鑒定方法，目前，已經(jīng)挖掘到的棒桿菌來源的滲透壓耐受性功能基因極少，從而限制了棒桿菌發(fā)酵性能的進一步提升。
為克服現(xiàn)有技術中的問題，技術人員首先構建了一種基于谷氨酸棒桿菌全基因組單基因過表達庫的功能基因的高通量篩選方法，用于高通量快速地篩選能提高菌株對高滲透壓力的耐受性的功能基因，從而提升菌株的氨基酸產(chǎn)量。在此基礎上完成本發(fā)明。
賴氨酸高滲透壓條件過表達提高生長基因的初篩
構建的C.glutamicum ATCC13032全基因組單基因過表達庫，共計3000多個菌株，分別進行賴氨酸高滲透壓條件的生長初篩。種子和高滲透壓培養(yǎng)均采用Bioscreen C全自動微生物生長曲線分析儀進行培養(yǎng)和測定OD600。種子培養(yǎng)如下：將C.glutamicum ATCC13032全基因組單基因過表達庫的過表達菌株與對照菌株C.glutamicum ATCC13032(pEC-0)分別接種到含有25μg/mL卡那霉素的TSB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)體系為48孔板，裝液400μL，30℃培養(yǎng)8h。
取10μL培養(yǎng)好的種子液，分別轉(zhuǎn)接到賴氨酸高滲培養(yǎng)基中，培養(yǎng)體系為48孔板，裝液400μL，培養(yǎng)基含有0.04mM的IPTG和25μg/mL卡那抗生素，30℃，800rpm培養(yǎng)96-106h，設置每隔1h測定OD600，全面篩選過表達可以提高以上高滲透壓條件細胞生長的基因。高滲培養(yǎng)基成分為(g/L)：(NH4)2SO4，20g/L；尿素，5g/L；KH2PO4，1g/L；K2HPO4·3H2O，1.3g/L；MOPS，42g/L；CaCl2，0.01g/L；FeSO4·7H2O，0.01g/L；MnSO4·H2O，0.01g/L；ZnSO4·7H2O，0.001g/L；CuSO4，0.0002g/L；NiCl·6H2O，0.00002g/L；gSO4·7H2O，.25g/L；原兒茶酸，0.03g/L；VB1，0.0001g/L；生物素，0.0002g/L；酵母粉，2g/L；葡萄糖，40g/L；賴氨酸，175g/L；H2SO4調(diào)節(jié)pH 7.1-7.2。所有過表達菌株的每個時間點OD600分別與對照菌株計算比值，歸一化處理所有批次數(shù)據(jù)，再計算30h至終點生長過程連續(xù)15個最大值的平均值，然后將15個值均提高或降低20％以上的基因判定為生長提高或降低基因。
所有基因均顯示了30h至終點生長過程連續(xù)15個最大值的平均值，其中最上面的深色點是15個值均提高20％以上的基因，下面的深色點代表15個值均降低20％以上的基因。生長提高的基因一共29個，包括以下基因cgl0011、cgl0063、cgl0470、cgl0487、cgl0489、cgl0490、cgl0893、cgl0917、cgl0923、cgl1010、cgl1118、cgl1367、cgl1472、cgl1532、cgl1541、cgl1605、cgl1653、cgl1941、cgl1994、cgl2392、cgl2496、cgl2610、cgl2735、cgl2806、cgl2937、cgl2911、cgl2998、cgl3003、cgl3098。
賴氨酸高滲透壓生長提高基因的復篩
將初篩所得到的29個生長提高的基因，進行賴氨酸高滲透壓和非高滲透壓的復篩。將初篩所得到的29個基因的過表達菌株和C.glutamicum ATCC13032(pEC-0)對照菌株，分別接種至含有25μg/mL卡那霉素的TSB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)體系為48孔板，裝液400μL，30℃培養(yǎng)8h。按照初始OD600
為0.1分別轉(zhuǎn)接至非高滲和高滲培養(yǎng)基中，培養(yǎng)體系為48孔板裝液400μL，添加0.04mM的IPTG和25μg/mL卡那抗生素，30℃，800rpm培養(yǎng)96h至106h，每2h檢測一次OD600，實驗設置三個平行。依然使用Bioscreen C全自動微生物生長曲線分析儀進行培養(yǎng)和測定OD600。
高滲培養(yǎng)基成分為(g/L)：(NH4)2SO4，20g/L；尿素，5g/L；KH2PO4，1g/L；K2HPO4·3H2O，1.3g/L；MOPS，42g/L；CaCl2，0.01g/L；FeSO4·7H2O，0.01g/L；MnSO4·H2O，0.01g/L；ZnSO4·7H2O，0.001g/L；CuSO4，0.0002g/L；NiCl·6H2O，0.00002g/L；MgSO4·7H2O，0.25g/L；原兒茶酸，0.03g/L；VB1，0.0001g/L；生物素，0.0002g/L；酵母粉，2g/L；葡萄糖，40g/L；賴氨酸，175g/L；H2SO4調(diào)節(jié)pH 7.1-7.2之間。非高滲培養(yǎng)基為在上述高滲培養(yǎng)基不添加賴氨酸。所有菌株的3個平行樣品每個時間點OD600分別計算平均值和標準偏差，繪制每個菌株非高滲和高滲條件的生長曲線。再分析30h至終點生長過程每個時間點樣品過表達菌株與對照菌株OD600
差異顯著性(T-test分析)，如果滿足高滲條件連續(xù)15個時間點及以上是P＆lt;0.05，且這些點的過表達菌株OD600
平均值均大于對照菌株，則該基因過表達可以提高賴氨酸高滲條件的菌株生長。初篩獲得的29個基因，復篩后只有15個基因滿足以上要求，非高滲和高滲條件的生長曲線如圖1所示，可以看出cgl0063、cgl0470、cgl0917、cgl0923、cgl1010、cgl1118、cgl1472、cgl1994、cgl2392、cgl2496、cgl2610、cgl2806、cgl2911、cgl2998和cgl3003仍然是在高滲條件提高菌株生長；同時發(fā)現(xiàn)cgl3003的過表達不僅可以提高菌株在高滲條件下的生長，也可以提高菌株在非高滲條件的生長；其它基因過表達只在高滲條件下提高菌株的生長。在賴氨酸高滲條件，滿足上述標準的基因在生長提高階段時間點中最大提高幅度如下：cgl0063在68h最大可提高16％，cgl0470在72h最大可提高24％，cgl0917在66h最大可提高18％，cgl0923在72h最大可提高14％，cgl1010在72h最大可提高36％，cgl1118在42h最大可提高52％，cgl1472在72h最大可提高33％，cgl1994在96h最大可提高16％，cgl2392在72h最大可提高25％，cgl2496在90h最大可提高43％，cgl2610在90h最大可提高51％，cgl2806在90h最大可提高53％，cgl2911在103h最大可提高28％，cgl2998在104h最大可提高36％，cgl3003在60h最大可提高23％。
圖1.賴氨酸高滲透壓耐受基因的復篩結果；
圖2賴氨酸高滲透壓耐受基因在硫酸鈉高滲條件下的生長
15個耐高滲基因?qū)α蛩徕c滲透壓耐受性的驗證
將復篩所獲得的15個的基因過表達菌株和ATCC13032(pEC-0)對照菌株分別接種至含有25μg/mL卡那霉素的TSB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)8h，按照初始OD600
為0.1分別轉(zhuǎn)接硫酸鈉高滲培養(yǎng)基中，培養(yǎng)體系為48孔板裝液400μL每孔含有0.04mM的IPTG和25μg/mL卡那抗生素，使用Bioscreen C全自動微生物生長曲線分析儀30℃800rpm培養(yǎng)96h至120h，每2h檢測OD600，實驗三個平行，全面表征15個基因在谷氨酸棒桿菌高滲透壓力響應與耐受中的功能。高滲培養(yǎng)基為在非高滲培養(yǎng)基中添加156g/L硫酸鈉。檢測結果如圖2所示，采用相同的標準進行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)15個基因在硫酸鈉高滲條件下也能提高生長。以上結果表明，復篩所得到的15個基因過表達對于提高谷氨酸棒桿菌的高滲透壓耐受性具有有益效果。在硫酸鈉高滲條件下，生長提高階段中，cgl0063在64h最大可提高25％，cgl0470在118h最大可提高40％，cgl0917在50h最大可提高37％，cgl0923在26h最大可提高44％，cgl1010在26h最大可提高46％，cgl1118在60h最大可提高11％，cgl1472在26h最大可提高36％，cgl1994在118h最大可提高20％，cgl2392在26h最大可提高63％，cgl2496在h最大可提高60％，cgl2610在26h最大可提高52％，cgl2806在26h最大可提高28％，cgl2911在26h最大可提高87％，cgl2998在26h最大可提高83％，cgl3003在26h最大可提高92％。
總結：通過對谷氨酸棒桿菌中的15種提高微生物滲透壓耐受性功能基因的過表達，發(fā)現(xiàn)其可以提高菌株對于高滲透壓力的耐受性，促進出發(fā)菌株生長，從而提升菌株的氨基酸產(chǎn)量。
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