海洋環(huán)境是生物產(chǎn)生新型生物活性化合物和有趣蛋白質(zhì)的來源。海洋細(xì)菌引起了人們的廣泛關(guān)注，但近年來隨著對海洋真菌的分離和收集的增加，人們對海洋真菌的興趣也有所增長。篩選新化合物通常涉及在有限條件下培養(yǎng)的大量生物，或在包括脅迫在內(nèi)的更廣泛條件下培養(yǎng)的幾種生物。微量滴定板和相關(guān)自動化工具的開發(fā)極大地促進(jìn)了單細(xì)胞酵母和細(xì)菌生長動力學(xué)數(shù)據(jù)的獲取。微量滴定板中的生長通常以光密度測量。微量滴定板很少用于獲得絲狀真菌的動力學(xué)數(shù)據(jù)，絲狀真菌可能無法在孔中均勻生長。絲狀真菌生長為分支菌絲體，分裂時無細(xì)胞分離。不過有研究人員證明光密度為真菌作為分散菌絲生長的菌株提供了一種有意義的生長測量方法。通過在測量中增加均化步驟，擴(kuò)大了光密度的使用范圍，以監(jiān)測絲狀真菌的生長，并指出碎裂程度會影響光密度與細(xì)胞干生物量之間的關(guān)系。相關(guān)發(fā)現(xiàn)，在評估許多海洋真菌的生長時，光密度測量比顯微鏡方法更實(shí)用。


本論文研究人員使用Bioscreen C全自動生長曲線分析儀中100孔蜂窩平板培養(yǎng)和在自動培養(yǎng)箱中對96孔酶標(biāo)板培養(yǎng)進(jìn)行比較，以評估從海洋環(huán)境中分離出的幾種絲狀真菌在四種潛在碳源（葡萄糖，木糖，半乳糖和甘油）上的生長。該研究將為菌株評估提供一致的動力學(xué)增長數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)可用于指導(dǎo)目標(biāo)菌株的工藝放大。


Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應(yīng)用


使用Bioscreen C全自動生長曲線分析儀對真菌微生物進(jìn)行培養(yǎng)，在含有290μl培養(yǎng)基的100孔蜂窩板2板（孔深14 mm，孔直徑頂部7 mm）中進(jìn)行培養(yǎng)。以10μl微生物為接種物，為孢子形成菌株提供的最終分生孢子濃度為每毫升1至6 x 10 4分生孢子。P.chrysogenum KF657是一個例外，每毫升接種4 x 105分生孢子。將A.cruciatus LF680菌絲勻漿稀釋15倍于水，10μl作為接種物。以冰凍菌絲懸液接種varia KF560。接種前將冷凍懸浮液稀釋30倍，將轉(zhuǎn)移的甘油減少到0.22 g-1，接種物中的葡萄糖和蛋白胨對培養(yǎng)井的貢獻(xiàn)小于22 mg-1。將100孔蜂窩板在24°C下以中等速度和最大振幅（頻率為10 Hz，以線性提供600 rpm轉(zhuǎn)速而不是軌道運(yùn)動）連續(xù)搖動孵育。每隔30分鐘在600 nm處測量光密度（OD）長達(dá)10天。


實(shí)驗(yàn)結(jié)果：八種海洋真菌的能夠在BioScreen C全自動生長曲線分析儀或自動化培養(yǎng)箱中的四種底物上生長。研究發(fā)現(xiàn)海洋真菌菌株在Bioscreen C全自動生長曲線分析儀比在自動化培養(yǎng)箱生長得更好，復(fù)制也更相似。自動化培養(yǎng)箱中復(fù)制品之間的高度差異意味著通常只能（統(tǒng)計(jì)上）區(qū)分生長與不生長之間的差異，而無法區(qū)分菌株在木糖，葡萄糖或半乳糖上是否生長得更好。由于復(fù)制品在Bioscreen C全自動生長曲線分析儀中比在自動化培養(yǎng)箱中顯示出更少的變異，濕度控制和搖動的差異可能是造成Bioscreen C全自動生長曲線分析儀和自動化培養(yǎng)箱生長差異的原因。與Bioscreen C中相比，在自動化培養(yǎng)箱中使用的96孔標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)板中生長時，菌絲體更可能聚集為沉淀物。在自動化培養(yǎng)箱中使用的96孔酶標(biāo)板中培養(yǎng)物的大誤差條（相對標(biāo)準(zhǔn)誤差為10–30％，有時更高）中可以看到重復(fù)之間的差異。相比之下，Bioscreen C全自動生長曲線分析儀使用的100孔蜂窩平板的生長大部分分散，各孔之間具有良好的重現(xiàn)性。自動化培養(yǎng)箱中使用的96孔酶標(biāo)板中培養(yǎng)物還受到96孔板蓋子上的凝結(jié)的影響，并從板邊緣的孔中蒸發(fā)出液體，導(dǎo)致在96孔酶標(biāo)板的孔邊緣產(chǎn)生了比實(shí)際更高OD值，特別是在使用固定相培養(yǎng)基的環(huán)境下。在所有條件下，所有菌株均觀察到較長的滯后階段（30–100小時），通常在自動化培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)要比在Bioscreen C中更長。

圖1、接種物中甘油和分生孢子濃度的對比生長速率，最大OD和近似滯后時間的測量的影響。產(chǎn)黃青霉LF654菌絲體在Bioscreen C的100孔板中以300μL培養(yǎng)液在pH值為4.25的緩沖液中（帶有實(shí)心符號）或不添加（空心符號）葡萄糖（2 g L-1）的緩沖液中生長。

圖2、A）P.chrysogenum KF657，B）D.salina LF304，C）H.varia KF560，D）A.cruciatus LF680，E）Tritiracium sp.。LF562，F(xiàn)）P.pinophilum LF458，G）M.brevicaulis LF580和H）Calcarisporiumsp.KF525的光密度值。菌絲體在pH值為4.25的特定培養(yǎng)基中生長，其中葡萄糖（紅色），木糖（藍(lán)色），半乳糖（青色）或甘油（綠色）作為碳源，或在100孔中300μl培養(yǎng)物中不添加碳源（灰色）Bioscreen C（1）中的微孔板或自動化培養(yǎng)箱（2）中96孔板（酶標(biāo)板）中的150μl培養(yǎng)物。

圖3.P.chrysogenum KF657的光密度。在以葡萄糖，木糖，半乳糖或甘油為碳源，在pH 4.25緩沖的特定培養(yǎng)基中生長的，在自動化培養(yǎng)箱的96孔酶標(biāo)板中以150μl培養(yǎng)物（在大圖中）或在Bioscreen C全自動生長曲線分析儀的100孔板中以300μl體積的培養(yǎng)物（小圖）。96孔板中的邊緣孔（灰色）分別表示為P1 S2，P1 S3，P1 S5和P1 S4，以及100孔板中的111、112、141和131孔。

圖4、在微量滴定板上培養(yǎng)的海洋真菌的最大OD值

圖5、在微量滴定板上培養(yǎng)的海洋真菌的比生長率（h-1）。


總結(jié):本論文使用Bioscreen C全自動生長曲線分析儀中100孔蜂窩平板培養(yǎng)和在自動化培養(yǎng)箱中對96孔酶標(biāo)板培養(yǎng)進(jìn)行比較，以評估從海洋環(huán)境中分離出的幾種絲狀真菌在四種潛在碳源（葡萄糖，木糖，半乳糖和甘油）上的生長。各種海洋真菌可產(chǎn)生有趣的生物活性化合物，但要擴(kuò)大這些化合物的產(chǎn)量可能具有挑戰(zhàn)性，特別是因?yàn)橥ǔιa(chǎn)生物體如何生長知之甚少。研究人員評估了使用了Bioscreen C全自動生長曲線分析儀的100孔蜂窩板或自動化培養(yǎng)箱和96孔酶標(biāo)板板對8種絲狀海洋真菌，6種孢子形成和2種非孢子形成的適宜性進(jìn)行培養(yǎng)研究，高通量獲取生長和底物(葡萄糖、木糖、半乳糖或甘油)利用的數(shù)據(jù)。在這兩個培養(yǎng)系統(tǒng)中，所有八種真菌均能生長，但與Bioscreen全自動生長曲線分析儀測試的數(shù)據(jù)相比，自動化培養(yǎng)箱獲得的數(shù)據(jù)生長更易變，且噪聲更大。而在Bioscreen C中生長的菌株的特定生長率在0.01(不添加底物)到0.07 h-1之間，在自動化培養(yǎng)箱中的96孔板中（常規(guī)酶標(biāo)板）生長的菌株在0.01到0.27 h-1之間。Bioscreen C全自動生長曲線分析儀和自動化培養(yǎng)箱這兩個系統(tǒng)都可以提供絲狀真菌的生理數(shù)，但是，由于來自動化培養(yǎng)箱中的96孔板中（常規(guī)酶標(biāo)板）的數(shù)據(jù)中存在噪音，從自動化培養(yǎng)箱中的96孔板中（常規(guī)酶標(biāo)板）獲得的數(shù)據(jù)只能用于區(qū)分支持或不支持生長的底物，而Bioscreen C全自動生長曲線分析儀得到的數(shù)據(jù)還提供了有關(guān)底物偏好的信息。


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