人們曾經(jīng)認為D－氨基酸在生物進程中發(fā)揮著相對較少的作用，并稱之為“非天然氨基酸”。然而近期的研究表明，D－氨基酸在細胞結構及信號調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，科學家們認為闡明D－氨基酸如何調(diào)控細胞壁重塑及生物被膜降解的機制不僅能夠?qū)毎|(zhì)外的進程有一個新的理解，并且能夠促進新療法的發(fā)展［1］。隨著研究的不斷深入，D－氨基酸在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和食品等領域的用途被迅速發(fā)掘，如D－氨基酸及其衍生物作為重要的手性原材料被廣泛地應用于半合成抗生素、多肽激素、殺蟲劑和甜味劑等的合成中。
目前，隨著應用的推廣，D－氨基酸的工業(yè)需求量也逐漸增大。D－氨基酸制備方法主要有：對映體拆分法、化學合成法和生物法。酶法合成作為生物法中應用最多的方法，具有無污染、反應條件溫和、操作簡便、成本低、產(chǎn)物純度高等優(yōu)點，展現(xiàn)出很好的商業(yè)前景［6］。在酶法合成D－氨基酸的過程中，D－氨基?；甘侵饕褂玫膸追N酶之一。迄今已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)D－氨基酰化酶的微生物包括產(chǎn)堿菌屬、假單胞菌屬、貪噬菌屬、狹長平胞屬、擬無枝酸菌屬、博德特菌屬、葡萄糖菌屬、甲基桿菌屬、類諾卡氏菌屬、微桿菌屬、鏈霉菌屬和木霉屬等［7］。其中，來自產(chǎn)堿菌屬的D－氨基?；敢呀?jīng)應用于工業(yè)化生產(chǎn)［8］。然而，國內(nèi)對D－氨基?；傅难芯窟€處于基礎階段，商品酶仍需進口。
土壤篩選是獲得產(chǎn)酶微生物的重要途徑。作者從氨基酸類化工廠附近土樣中篩選產(chǎn)D－氨基酰化酶的菌株，并對活性較高的菌株進行了鑒定及培養(yǎng)條件的初步優(yōu)化。
1實驗
1.1材料與試劑
土樣采自江蘇省某氨基酸類化工廠排污區(qū)附近。
細菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒，上海生工生物工程有限公司；250bp DNA Ladder Marker，寶生物工程（大連）有限公司；Taq DNA聚合酶，北京康為世紀有限公司；DNA引物（PAEG純），上海捷瑞公司；其它化學試劑均為分析純或色譜純。
1.2培養(yǎng)基
分離培養(yǎng)基：N－乙酰－D－甲硫氨酸1%，K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，瓊脂2%，蒸餾水配制，調(diào)節(jié)pH值至7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基：N－乙酰－D－甲硫氨酸1%，K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸膏2%，蒸餾水配制，調(diào)節(jié)pH值至7.0。
1.3方法
1.3.1菌株的分離
采用平板稀釋法從土樣中分離菌株。取土壤樣品5g，用無菌生理鹽水逐級稀釋至10－1、10－2、10－3、10－4、10－5數(shù)量級，各取0.2mL均勻涂布于分離平板上，每個稀釋度涂3個平板，30℃倒置培養(yǎng)48h。觀察并挑選生長快速、菌落較大的菌株劃線純化，純化的菌株斜面置于4℃冰箱保存［9］。
1.3.2菌株的篩選
1.3.2.1初篩
將純化的菌株轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、200 r·min－1搖瓶培養(yǎng)48h。低溫離心收集菌體，菌體用適當比例的50mmol·L－1Tris－HCl緩沖溶液（pH值7.8）充分懸浮，加入適量200mmol·L－1的底物N－乙酰－D－甲硫氨酸至濃度為20mmol·L－1，混合均勻，于37℃恒溫水浴振蕩1h，之后立即沸水浴10min終止反應。離心后取上清液1μL點樣進行蛋氨酸的硅膠薄層層析，展開劑為V（正丁醇）∶V（冰乙酸）∶V（水）＝4∶1∶1。每次需展開劑25mL，另加入1mL 0.5%茚三酮溶液，混合均勻，展開結束后，電吹風熱風吹干；顯色斑點與0.05mmol·L－1蛋氨酸的標樣斑點比較，檢測蛋氨酸的含量以反映D－氨基酰化酶的活力。為了消除所用試劑和菌體本身所含氨基酸對測定的干擾，將懸浮后的菌體先煮沸10min，然后加入底物，其余操作同上，作為空白對照。保留蛋氨酸斑點較大且無雜斑點的菌株進行復篩［10］。
1.3.2.2復篩
將初篩保留的菌株轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、200r·min－1搖瓶培養(yǎng)48h；采用茚三酮比色法測定酶活［10］，方法同1.3.2.1。
酶活力單位（U）定義：在pH值7.8、37℃條件下，1min內(nèi)酶催化底物水解釋放出1μmol D－甲硫氨酸為1U。
1.3.3菌株A55的鑒定
1.3.3.1形態(tài)學特征觀察及生理生化特征測定
依據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第八版）［11］和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［12］進行試驗，鑒定菌種。
1.3.3.2菌株A55的16SrDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析
利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株A55的基因組DNA。以基因組DNA為模板，用細菌16S rDNA基因通用引物進行PCR擴增。PCR擴增參數(shù)：94℃預變性4min；94℃解鏈40s，55℃退火40s，72℃延長1.5min，30個循環(huán)；最后72℃延長10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測，純化后交南京思普金公司測序。將測序得到的16SrDNA序列通過Blast與GenBank中細菌及古菌的16SrDNA序列進行比對，利用Mega5.2軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用鄰接法（neighbor－joining method）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹進行自舉分析（bootstrap method，1 000次重復），估算其內(nèi)分支的支持率［13］。
1.3.4影響D－氨基?；负铣傻囊蛩乜疾?
以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，考察培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值、搖床轉速、搖瓶裝樣量、菌齡、碳源、氮源等對菌體生長及酶活力的影響，優(yōu)化菌株A55的培養(yǎng)條件［14］。
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