《中國(guó)獸藥典》二〇一〇年版三部規(guī)定支原體培養(yǎng)基制成后需進(jìn)行質(zhì)控檢驗(yàn)，合格后方可用于生物制品的支原體檢驗(yàn)[1]。用于質(zhì)控檢驗(yàn)的質(zhì)控菌株分別為滑液支原體(CVCC2960)和豬鼻支原體(CVCC361)?；褐гw用于改良Frey氏液體培養(yǎng)基、改良Frey氏固體培養(yǎng)基的質(zhì)控檢驗(yàn);豬鼻支原體用于支原體液體培養(yǎng)基、支原體固體培養(yǎng)基、無(wú)血清支原體培養(yǎng)基的質(zhì)控檢驗(yàn)。為了解兩種質(zhì)控菌株的生長(zhǎng)繁殖特性，本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定兩種菌株在不同培養(yǎng)時(shí)段的CCU(color change unit，CCU)，繪制生長(zhǎng)曲線并確定世代時(shí)間，為支原體檢驗(yàn)用培養(yǎng)基的質(zhì)控檢驗(yàn)提供數(shù)據(jù)參考。


1材料與方法


1.1材料


1.1.1菌株滑液支原體(CVCC2960)、豬鼻支原體(CVCC361)，均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。


1.1.2培養(yǎng)基


1.1.2.1改良Frey氏液體培養(yǎng)基配方為:氯化鈉(5.0 g/L)，氯化鉀(0.4 g/L)，硫酸鎂(含7個(gè)結(jié)晶水)(0.2 g/L)，磷酸氫二鈉(含12個(gè)結(jié)晶水)(1.6 g/L)，磷酸二氫鉀(0.2 g/L)，葡萄糖(10.0 g/L)，乳蛋白水解物(5.0 g/L)，酵母粉(5.0 g/L)，1%輔酶I溶液(10.0 mL/L)，1%L-半胱氨酸溶液(10.0 mL/L)，2%精氨酸溶液(20.0 mL/L)，馬血清(100.0 mL/L)，1%酚紅溶液(1.0 mL/L)，青霉素(800 IU/mL)，1%醋酸鉈溶液(10.0 mL/L)，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.6～7.8，濾過(guò)除菌，置4℃保存?zhèn)溆谩?


1.1.2.2支原體液體培養(yǎng)基配方為:PPLO肉湯粉(21.0 g/L)，葡萄糖(5.0 g/L)，10%精氨酸溶液(10.0 mL/L)，10倍MEM培養(yǎng)液(10.0 mL/L)，酵母粉(5.0 g/L)，青霉素(800 IU/mL)，1%醋酸鉈溶液(10.0 mL/L)，馬血清(100.0 mL/L)，1%酚紅溶液(1.0 mL/L)，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.6～7.8，濾過(guò)除菌，置4℃保存?zhèn)溆谩?


1.1.3儀器生物安全柜;37℃恒溫培養(yǎng)箱;電子天平;pH計(jì);濾器;冰柜。


1.2方法


1.2.1菌液培養(yǎng)


1.2.1.1滑液支原體將-20℃凍存的滑液支原體菌株恢復(fù)原體積后，按5%比例接種到10 mL改良Frey氏液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取培養(yǎng)后的菌液，按照5%比例傳3代，取生長(zhǎng)穩(wěn)定的菌液作為待測(cè)菌液，按5%比例接種培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從0 h開(kāi)始，每隔6 h進(jìn)行一次活菌計(jì)數(shù)。


1.2.1.2豬鼻支原體將-20℃凍存的豬鼻支原體菌株恢復(fù)原體積后，按5%比例接種到10 mL支原體液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取培養(yǎng)后的菌液，按照3%比例傳3代，取生長(zhǎng)穩(wěn)定的菌液作為待測(cè)菌液，按3%比例接種培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從0 h開(kāi)始，每隔6 h進(jìn)行一次活菌計(jì)數(shù)。


1.2.2生長(zhǎng)曲線繪制從0 h開(kāi)始，每隔6 h從待測(cè)菌液中取樣，采用10倍系列稀釋計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。具體方法是:將培養(yǎng)基分裝成每管1.8 mL，第1管加入待測(cè)菌液0.2 mL，混勻后，取0.2 mL加入第2管中，再混勻，取0.2 mL加入到第3管中，依此操作一直至第10管，將第10管中混勻后取0.2 mL棄去。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣3份，將試管置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，試驗(yàn)設(shè)未接種菌液的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。每天觀察試管培養(yǎng)基顏色變化，直至培養(yǎng)基顏色不再變化時(shí)，結(jié)束觀察。判定滴度:以培養(yǎng)基顏色變化的最高稀釋度作為待測(cè)菌液的生長(zhǎng)滴度，即CCU表示[2]。用3份樣品的平均CCU，n=3)表示該時(shí)間點(diǎn)支原體CCU。以取樣時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，平均CCU的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。


1.2.3世代時(shí)間的計(jì)算世代時(shí)間(generation time)[3]，即菌體每繁殖一代所需的時(shí)間，用G表示。分別取滑液支原體、豬鼻支原體生長(zhǎng)曲線對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中的一段，按如下公式計(jì)算世代時(shí)間:

式中，G為世代時(shí)間，t為培養(yǎng)時(shí)間，Mo為開(kāi)始時(shí)的活菌數(shù)，Mt為經(jīng)t時(shí)間培養(yǎng)后的活菌數(shù)。


2結(jié)果


2.1質(zhì)控菌株在培養(yǎng)基中不同生長(zhǎng)時(shí)段的CCU結(jié)果如表1、表2所示。從表1可以看出，滑液支原體在改良Frey氏液體培養(yǎng)基中最高可生長(zhǎng)至7.0×108CCU/mL，54 h后活菌數(shù)開(kāi)始下降，直至96 h滴度為0。從表2看出，豬鼻支原體在支原體液體培養(yǎng)基中最高可生長(zhǎng)至1.0×109CCU/mL，且在126 h之后活菌數(shù)開(kāi)始下降，直至216 h滴度為0。

表1滑液支原體不同生長(zhǎng)時(shí)段的CCU及對(duì)數(shù)值

表2豬鼻支原體不同生長(zhǎng)時(shí)段的CCU及對(duì)數(shù)值



2.2質(zhì)控菌株的生長(zhǎng)曲線圖從圖1可知，滑液支原體菌株在接種后6 h內(nèi)為遲緩期，6～36 h為對(duì)數(shù)期，36～54 h為穩(wěn)定期，54 h之后為衰老期。從圖2可知，豬鼻支原體菌株在接種后6 h內(nèi)是遲緩期，6～18 h為對(duì)數(shù)期，18～126 h為穩(wěn)定期，126 h之后為衰老期。

2.3質(zhì)控菌株的世代時(shí)間滑液支原體對(duì)數(shù)期在6～36 h，t1=12 h，t2=30 h，代入公式，滑液支原體世代時(shí)間G=231.8 min;豬鼻支原體對(duì)數(shù)期在6～18 h，t1=6 h，t2=18 h，代入公式，豬鼻支原體世代時(shí)間G=117.1 min。


3討論


3.1《中國(guó)獸藥典》[1]規(guī)定滑液支原體和豬鼻支原體作為支原體培養(yǎng)基檢驗(yàn)用質(zhì)控菌株，傳代培養(yǎng)均不得超過(guò)5代。支原體質(zhì)控菌株開(kāi)啟后，在適宜液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，為使支原體在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)穩(wěn)定，連續(xù)培養(yǎng)直至第3代，用第3代菌液培養(yǎng)物作為培養(yǎng)基質(zhì)控菌株的種子液，在用于質(zhì)控檢驗(yàn)時(shí)，將種子液繼續(xù)傳代，用第4代或第5代菌液培養(yǎng)物作為質(zhì)控菌株對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行檢驗(yàn)。為了保證質(zhì)控菌株在培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)速度穩(wěn)定、均一，菌液繁殖到第5代終止，不再繼續(xù)傳代。


3.2支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的原核微生物，它在液體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)曲線與細(xì)菌相同，可分為遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期、衰老期[4]。為保證質(zhì)控菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定，菌株培養(yǎng)后每次傳代，均按照豬鼻支原體3%、滑液支原體5%的比例接種培養(yǎng)基，且每次傳代培養(yǎng)均在108CCU/mL數(shù)量級(jí)收獲菌液。從兩個(gè)質(zhì)控菌株生長(zhǎng)曲線圖分析，滑液支原體菌株最佳收獲時(shí)間在培養(yǎng)后36～54 h，豬鼻支原體菌株最佳收獲時(shí)間在培養(yǎng)后18～126 h，在此時(shí)段內(nèi)收獲的菌液，其CCU均維持在108～109CCU/mL數(shù)量級(jí)。但在研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時(shí)間相差6～12 h的支原體菌液顏色幾乎沒(méi)有差別，而CCU卻相差1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，這就提示在培養(yǎng)菌液過(guò)程中，把握好收獲時(shí)間至關(guān)重要。如果質(zhì)控菌株不在穩(wěn)定期中收獲，可能導(dǎo)致菌液滴度不夠高，即使使用的是合格的培養(yǎng)基，滴度也達(dá)不到合格的標(biāo)準(zhǔn)。所以，本研究提示在穩(wěn)定期及時(shí)收獲菌液、及時(shí)保存，才能保證支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基質(zhì)控菌株滴度的穩(wěn)定和均一，保證支原體培養(yǎng)基檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確。


3.3培養(yǎng)基質(zhì)量直接影響生物制品檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以質(zhì)控菌株作為一個(gè)衡量培養(yǎng)基合格與否的標(biāo)尺，更是起到了至關(guān)重要的作用。目前，現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》在質(zhì)控菌株標(biāo)準(zhǔn)化方面還沒(méi)有十分具體的規(guī)定。雖然試驗(yàn)初次通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線和確定世代時(shí)間來(lái)探索質(zhì)控菌株的生長(zhǎng)規(guī)律，為培養(yǎng)基檢驗(yàn)及質(zhì)控菌株的使用提供了一定的數(shù)據(jù)參考，但是質(zhì)控菌株的標(biāo)準(zhǔn)化工作還需大量試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，例如質(zhì)控菌株的傳代次數(shù)、菌液接種培養(yǎng)基的適宜比例、生長(zhǎng)滴度變化等方面還需進(jìn)一步確證并作詳細(xì)規(guī)定。另外，在質(zhì)控菌株培養(yǎng)方面，傳統(tǒng)上一直采用肉眼觀察的方式對(duì)培養(yǎng)液顏色進(jìn)行判斷，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)此方法準(zhǔn)確性不高，且不同試驗(yàn)人員判斷亦存在差異，建議采用酸度計(jì)測(cè)定取代肉眼觀察方法，使試驗(yàn)結(jié)果更可信。


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