生物膜是附著在表面并封閉在細胞外聚合物基質(zhì)(EPS)中的結構化微生物聯(lián)合體。與浮游狀態(tài)下的細胞相比，生物膜的主要特性是對抗菌劑和其他類型壓力的高抵抗力。這使得生物膜很難根除。生物膜存在于醫(yī)學領域的許多類型的非生物表面上，由于它們可以儲存和分散多種感染因子，因此會導致慢性感染等嚴重問題。假單胞菌在環(huán)境中無處不在，其中一些會導致動植物感染。在假單胞菌屬物種中，銅綠假單胞菌是一種普遍存在的機會性人類病原體，可引起廣泛的急性和慢性危及生命的感染，尤其是在免疫系統(tǒng)受到抑制的患者。腸球菌種類中，糞腸球菌是最普遍的醫(yī)療保健相關病原體，通常引起菌血癥、尿路感染、膿腫感染、腹膜炎、心內(nèi)膜炎以及褥瘡和足部潰瘍。80–90%的醫(yī)療保健相關腸球菌感染都涉及這種細菌。
生物膜結構細菌對抗生素和其他抗菌劑成分的耐藥性主要由EPS基質(zhì)支持，這限制了生物膜內(nèi)殺菌劑的傳輸。因此，需要一種有效滅活細菌生物膜細胞的新方法來控制生物膜。研究人員研究了將EPS降解酶與抗菌劑結合使用的策略在生物膜處理中的潛在應用。
EPS降解酶與生物殺滅劑結合使用時，可以分散嵌入生物膜中的細菌，從而實現(xiàn)更有效的消毒。以基質(zhì)為目標還可能擾亂粘彈性，從而進一步降低生物膜內(nèi)聚力并改善抗菌劑的獲取和效率。這種使用靶向基質(zhì)蛋白的蛋白水解酶與抗菌劑結合使用的方法尚未得到充分研究，無法有效滅活生物膜中的銅綠假單胞菌和糞腸球菌細胞。在這項研究中，研究人員研究了兩種能夠靶向基質(zhì)蛋白的蛋白水解酶胃蛋白酶和胰蛋白酶降解銅綠假單胞菌和糞腸球菌的潛力生物膜和與香芹酚結合時的協(xié)同效應，香芹酚是一種天然單萜酚，具有廣泛的抗菌和抗生物膜活性。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應用
肉湯微量稀釋法用于確定香芹酚對兩種細菌菌株的最小抑菌濃度(MIC)。使用無菌Müller–Hinton肉湯將細菌懸浮液調(diào)整至106 CFU mL-1。首先，將100μL MHB添加到微量滴定板的每個孔中。然后，在0.156至10 mg mL-1的微量滴定板中制備輔以DMSO的香芹酚溶液的兩倍連續(xù)稀釋液.最后，每孔加入100μL細菌懸浮液。陰性對照中不添加細菌，含有DMSO的陽性對照中不添加抗菌劑。將板在37°C下在Bioscreen C中培養(yǎng)，同時連續(xù)攪拌，并在24小時內(nèi)每2小時讀取一次OD600 nm。
實驗結果
結果表明，銅綠假單胞菌和糞腸球菌胃蛋白酶或胰蛋白酶與香芹酚聯(lián)合處理比單獨使用香芹酚處理更能減少生物膜。與使用單一酶然后香芹酚處理相比，在順序酶處理后香芹酚處理后，兩種生物膜的減少明顯更為重要。這種提高的效率在落射熒光顯微鏡分析中也很明顯，該分析表明，單獨或順序使用酶，然后是香芹酚的聯(lián)合處理，表現(xiàn)出酶的分散活性和香芹酚抗微生物活性的協(xié)同作用，因為生物膜在以下方面更加減少生物量和生存能力。蛋白質(zhì)可以成為去除的良好目標，以允許香芹酚等消毒劑有效滲透，以滅活生物膜中的銅綠假單胞菌和糞腸球菌細胞。酶和香芹酚可以通過封裝到非生物材料中來穩(wěn)定。包封可以增強這些活性劑的抗生物膜活性并提高其穩(wěn)定性。
圖1、香芹酚對銅綠假單胞菌(a)(5 mg mL?1)和糞腸球菌(b)(0.625 mg mL?1)浮游細胞的最小抑制濃度(MIC)。在三個獨立實驗中，在24小時的孵育期內(nèi)，使用分光光度計以2小時的間隔在OD600 nm下使用不同濃度的香芹酚測量細菌濁度。使用含有DMSO的對照。
圖2、香芹酚對銅綠假單胞菌(a)(5 mg mL?1)和糞腸球菌(b)(0.625 mg mL?1)浮游細胞的最小抑制濃度(MIC)。在三個獨立實驗中，在24小時的孵育期內(nèi)，使用分光光度計以2小時的間隔在OD600 nm下使用不同濃度的香芹酚測量細菌濁度。使用含有DMSO的對照。
圖3、使用不同濃度(10?4–10 mg mL?1)和不同作用時間(30分鐘)的胃蛋白酶和胰蛋白酶分散已建立的銅綠假單胞菌(a,b)和糞腸球菌(c,d)生物膜。在37°C下在96孔聚苯乙烯板中研究生物膜分散。在OD600下測量總生物膜形成。結果表示為三個獨立實驗的平均值(±SD)。*p<0.05表示與使用Tukey檢驗的對照相比存在顯著差異。
圖4、銅綠假單胞菌(a,b)和糞腸球菌(c,d)細胞在胃蛋白酶(a,d)和胰蛋白酶(b,d)存在下于37°C下培養(yǎng)24小時的生長情況顫抖。在三個獨立的實驗中，在24小時的孵育期內(nèi)，使用分光光度計以2小時的間隔在OD600 nm處用不同濃度的酶測量細菌濁度。
圖5、用胃蛋白酶、胰蛋白酶處理后銅綠假單胞菌生物膜的落射熒光顯微圖像，或以1 mg mL?1的濃度連續(xù)處理兩者各1小時，或隨后用?MIC的香芹酚處理（2.5 mg mL?1)持續(xù)1分鐘。在用SYTO9（活細菌的綠色熒光）和碘化丙啶（死細菌的紅色熒光）染色后觀察細胞。對照代表用胰蛋白胨鹽肉湯處理的生物膜。
總結
生物膜由封閉在自產(chǎn)細胞外基質(zhì)中的微生物群落組成，該基質(zhì)主要負責生物膜的毒力。以這種基質(zhì)為目標可能是控制生物膜的有效策略。在這項工作中，研究人員檢查了兩種蛋白水解酶胃蛋白酶和胰蛋白酶降解銅綠假單胞菌和糞腸球菌的功效生物膜及其與香芹酚結合時的協(xié)同作用。酶的最小分散濃度(MDC)和接觸時間，以及香芹酚的最小抑制濃度(MIC)和接觸時間，是針對在聚苯乙烯表面上生長的生物膜確定的。對于在不銹鋼表面上生長的生物膜，胃蛋白酶或胰蛋白酶與香芹酚的組合處理與單獨的香芹酚處理相比，兩種生物膜的減少更為顯著。這種減少在連續(xù)處理兩種酶后更為顯著，其次是香芹酚，最大減少量銅綠假單胞菌為4.7 log CFU mL-1，對于糞腸球菌為3.3 log CFU mL-1。這種提高的效率在落射熒光顯微鏡分析中也很明顯。這些發(fā)現(xiàn)表明，蛋白酶分散活性和香芹酚抗微生物活性的綜合作用可能是控制銅綠假單胞菌和糞腸球菌生物膜的前瞻性方法。本研究工作表明，使用酶和精油的聯(lián)合治療可能是根除微生物生物膜感染的有前途的技術。這些天然試劑的使用將進一步減少化學試劑的使用、能源成本和生物膜控制所需的水消耗。
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