本文擬通過心肌細(xì)胞系的體外培養(yǎng)，繪制生長曲線，初步探討在高原體外培養(yǎng)動物心肌細(xì)胞的可行性和細(xì)胞的生長特性，為高原病研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
細(xì)胞計(jì)數(shù)和生長曲線法檢測細(xì)胞增殖
細(xì)胞接種當(dāng)天計(jì)為0d，在培養(yǎng)的1-15d間每天下午16點(diǎn)取3塊平皿的細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
使用CCK8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105后接種于96孔板，每孔加入100μL單細(xì)胞懸液，分別在培養(yǎng)的1-15d間，每天取5個孔檢測，檢測時每孔加入10μLCCK8溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1h，用酶標(biāo)儀在450nm測定吸光度。
細(xì)胞增殖能力
在心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的不同時間點(diǎn)，采用CCK8法繪制生長曲線(見圖)，從圖中可見0-1d天內(nèi)曲線呈現(xiàn)下降趨勢，1-7d曲線平緩上升，7-11d曲線急劇上升，11d后曲線逐漸變得平直且有下降趨勢。
圖高原環(huán)境體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞生長曲線
表1不同時間點(diǎn)培養(yǎng)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞細(xì)胞數(shù)(xˉ±s)
心肌細(xì)胞隨培養(yǎng)時間延長，數(shù)量不斷增加，在第5d時細(xì)胞數(shù)較第1d時增加了3倍，第7d時細(xì)胞再次倍增之后細(xì)胞進(jìn)入快速生長時期到第11d時細(xì)胞數(shù)達(dá)到頂峰，以后進(jìn)入平臺期（見表1）。
討論
目前我國對高原病細(xì)胞水平的研究主要側(cè)重于非高原地區(qū)模擬低氧條件的研究[1]。模擬的低氧條件與高原現(xiàn)場環(huán)境有很大的差異，例如缺氧持續(xù)的時間、全天內(nèi)不同時段氧分壓的細(xì)微改變、不同季節(jié)氧分壓的變化以及溫度、濕度等情況都是難以模擬的，所以在高原現(xiàn)場開展細(xì)胞水平、分子水平的研究對深入探討高原病的發(fā)病和病理機(jī)制較模擬條件下研究更有意義且更加有助于對疾病的認(rèn)識。
本研究在西藏大學(xué)高原醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成。采用單一樣本觀察的方法對高原環(huán)境體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞生長特性進(jìn)行研究。一般來講體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程分為潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期三個階段,本研究中結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞在高原條件下的生長曲線也分為三個階段，第一階段為潛伏期，該時間段正是細(xì)胞處在損傷修復(fù)、環(huán)境適應(yīng)和貼壁等過程，所以“生長曲線”從初接種的0d時有下降表現(xiàn)，1d時“生長曲線”趨于平緩，2d時“生長曲線”有上升趨勢；從第3d起可見曲線逐步上升說明細(xì)胞進(jìn)入了快速生長期即第二階段對數(shù)生長期，在這一階段細(xì)胞活力旺盛、增殖活躍、數(shù)量倍增明顯；隨著時間的進(jìn)一步推移從第11d開始曲線逐漸變得平直且有下降趨勢即進(jìn)入第三階段平臺期，這一階段細(xì)胞數(shù)量基本維持在恒定水平。從以上三個階段可以看出高原現(xiàn)場進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)較以往文獻(xiàn)報道[2-3]的非高原環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞所需的時間長且細(xì)胞生長的各個時段也較非高原地區(qū)要長[4-5]，推斷這一現(xiàn)象可能與高原低壓低氧有關(guān)。
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