三、研究結(jié)果
3.1.貫葉連翹提取物對細菌增殖的影響
如圖1A所示，貫葉連翹提取物對大腸桿菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的MIC值分別為40 mg/mL、>80 mg/mL、>80 mg/mL、40 mg/mL、20 mg/mL，表明貫葉連翹提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌表現(xiàn)出顯著的抗菌活性。特別是在測試的菌株中，藤黃微球菌是對貫葉連翹提取物最敏感的細菌。因此，選擇藤黃微球菌作為后續(xù)研究貫葉連翹提取物抗菌活性和機制的指示菌。
圖1.長柱金絲桃提取物對細菌增殖的影響。(A)長柱金絲桃提取物對測試菌株的最小抑菌濃度值。使用Synergy 4酶標儀在490 nm波長下測定各孔吸光度。(B)時間-效應(yīng)關(guān)系檢測。通過自動化測量系統(tǒng)在600 nm波長下測定吸光度。以未經(jīng)長柱金絲桃提取物處理的藤黃微球菌作為對照組。
3.2.貫葉連翹提取物對藤黃微球菌的抗菌作用
如圖1A所示，貫葉連翹提取物對藤黃微球菌的MIC值為20 mg/mL，MBC值等于MIC。此外，時間-效應(yīng)關(guān)系測定的結(jié)果也顯示，貫葉連翹提取物在20 mg/mL濃度下可以殺死細菌（圖1B），表明貫葉連翹提取物可能是一種對藤黃微球菌的殺菌劑。
3.3.貫葉連翹提取物對藤黃微球菌細胞蛋白質(zhì)的影響
如圖2所示，與對照組相比，在10 mg/mL和15 mg/mL濃度的貫葉連翹提取物作用下，藤黃微球菌細胞的蛋白質(zhì)被切割成小于10 kDa的片段。這些結(jié)果表明，貫葉連翹提取物可以顯著破壞藤黃微球菌維持正常生命活動所需的蛋白質(zhì)合成，最終殺死藤黃微球菌細胞。
圖2.長柱金絲桃提取物對藤黃微球菌細胞蛋白質(zhì)的影響。藤黃微球菌細胞蛋白質(zhì)經(jīng)12.0%SDS-PAGE分離，并用考馬斯亮藍染色顯影。M泳道：標記蛋白；1泳道：未經(jīng)長柱金絲桃提取物處理的藤黃微球菌細胞（CON）；2泳道：經(jīng)5 mg/mL長柱金絲桃提取物處理的藤黃微球菌細胞；3泳道：經(jīng)10 mg/mL長柱金絲桃提取物處理的藤黃微球菌細胞；4泳道：經(jīng)15 mg/mL長柱金絲桃提取物處理的藤黃微球菌細胞。
3.4.貫葉連翹提取物對藤黃微球菌細胞凋亡的影響
圖3.長柱金絲桃提取物誘導(dǎo)藤黃微球菌細胞凋亡。（A）Annexin V/PI染色結(jié)果。細胞被分為存活細胞、壞死細胞、早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞。（B）TUNEL檢測結(jié)果。TUNEL陽性細胞（綠色通道）。DAPI（藍色通道）用于定位細胞核。（C）DNA laddering檢測結(jié)果。DNA被分離并在用溴化乙錠染色的1.0%瓊脂糖凝膠上可視化。泳道M：標記；泳道1：未經(jīng)長柱金絲桃提取物處理的藤黃微球菌細胞（CON）；泳道2：經(jīng)5 mg/mL長柱金絲桃提取物處理的藤黃微球菌細胞；泳道3：經(jīng)10 mg/mL長柱金絲桃提取物處理的藤黃微球菌細胞；泳道4：經(jīng)15 mg/mL長柱金絲桃提取物處理的藤黃微球菌細胞。
如圖3A所示，在用載體培養(yǎng)8小時后，陰性組中僅發(fā)現(xiàn)少量凋亡細胞（0.1±0.8%）。然而，在用不同劑量的貫葉連翹提取物處理后，凋亡細胞的百分比從10.4±2.8%顯著增加到17.3±1.8%。此外，在對照組中幾乎檢測不到TUNEL陽性細胞，而在貫葉連翹提取物處理的藤黃微球菌細胞中，TUNEL陽性信號以劑量依賴性方式顯著增加（圖3B），證明用貫葉連翹提取物處理會導(dǎo)致藤黃微球菌DNA斷裂。此外，當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時，DNA被切割成180-200 bp的寡核苷酸片段。在本研究中，瓊脂糖凝膠電泳表明，藤黃微球菌細胞暴露于貫葉連翹提取物會導(dǎo)致明顯的DNA斷裂，而對照組未顯示任何DNA梯狀條帶，如圖3C所示。
總之，這些結(jié)果表明貫葉連翹提取物可以劑量依賴性地通過凋亡途徑誘導(dǎo)藤黃微球菌細胞死亡。
3.5.貫葉連翹提取物對藤黃微球菌細胞膜電位的影響
為了測試貫葉連翹是否通過破壞細胞膜誘導(dǎo)藤黃微球菌凋亡，使用Rhodamine 123染色分析細胞膜電位（ΔΨm）。如圖4所示，當(dāng)藤黃微球菌細胞用5、10、15 mg/mL的貫葉連翹提取物處理指定時間后，膜電位（ΔΨm）發(fā)生崩潰。觀察結(jié)果表明，貫葉連翹提取物可能通過膜介導(dǎo)的凋亡途徑發(fā)揮促凋亡作用。
圖4.經(jīng)Hypericum ascyron L.提取物處理后藤黃微球菌細胞膜電位喪失情況。采用羅丹明123染色法測定膜電位（Δψm），并通過流式細胞術(shù)進行分析。未經(jīng)Hypericum ascyron L.提取物處理的藤黃微球菌細胞作為對照組。
四、討論
在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)貫葉連翹提取物對革蘭氏陽性菌，尤其是藤黃微球菌，具有明顯的抗菌活性，且呈時間和劑量依賴性。貫葉連翹提取物可以顯著破壞藤黃微球菌維持正常生命活動所需的蛋白質(zhì)合成，從而誘導(dǎo)藤黃微球菌細胞死亡。
此處，本研究顯示貫葉連翹對革蘭氏陽性菌，尤其是藤黃微球菌的抗菌作用似乎強于對革蘭氏陰性菌的作用。眾所周知，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞壁存在顯著的結(jié)構(gòu)差異，例如后者具有外膜和獨特的周質(zhì)空間。我們認為，革蘭氏陽性菌缺乏外脂多糖膜可能允許金絲桃屬代謝物更容易滲透到細胞中。
凋亡通常被稱為生理性程序性細胞死亡，不同于壞死。細胞凋亡涉及細胞數(shù)量和生命活動的生物學(xué)調(diào)控，是一個重要的代謝過程。凋亡通過激活細胞內(nèi)在的自殺機制發(fā)生。最近的研究揭示了細菌中凋亡性死亡的證據(jù)，并表明凋亡途徑的激活參與了抗菌藥物的功能。Dwyer等人發(fā)現(xiàn)，除了膜去極化和DNA斷裂外，細菌中的凋亡樣死亡還以磷脂酰絲氨酸暴露于質(zhì)膜外葉和染色體濃縮為特征。在我們的研究中，隨著貫葉連翹提取物濃度的增加，細菌細胞的凋亡率呈劑量依賴性增加（圖3A），并且TUNEL測定的結(jié)果一致（圖3B）。在生物化學(xué)上，凋亡的特征是內(nèi)源性核酸酶的激活和DNA降解成180-200 bp的倍數(shù)片段，這在我們研究中的DNA斷裂測定中也可見到（圖3C）。這些結(jié)果表明，貫葉連翹提取物誘導(dǎo)的藤黃微球菌細胞死亡主要是由于凋亡。
活性氧（ROS）是呼吸生物代謝的天然副產(chǎn)物。ROS合成的誘導(dǎo)導(dǎo)致高反應(yīng)性自由基的形成，從而破壞細胞。通過形成自由基抑制細菌生長也被觀察到。ROS的過量產(chǎn)生可以攻擊細菌細胞膜脂質(zhì)，然后導(dǎo)致細菌細胞膜功能崩潰。ROS的產(chǎn)生和膜電位（ΔΨm）的破壞有助于藥物誘導(dǎo)的死亡。在本研究中，用貫葉連翹提取物處理的藤黃微球菌細胞的膜電位顯著喪失（圖4），證明貫葉連翹提取物誘導(dǎo)的藤黃微球菌細胞凋亡可能是通過膜介導(dǎo)的凋亡途徑。
據(jù)我們所知，這是第一篇關(guān)于貫葉連翹抗菌機制的論文。我們小組正在進行提取物的分離和化學(xué)表征，這為利用貫葉連翹的自然資源提供了可持續(xù)的可能性。總之，我們的數(shù)據(jù)可能為貫葉連翹在臨床上的使用提供合理基礎(chǔ)，并為開發(fā)新型抗菌藥物提供啟示。
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