2.5.最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）
采用MTT法測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞的增殖。簡(jiǎn)言之，將細(xì)菌細(xì)胞（10^6 CFU/mL）以200μL/孔接種到96孔微孔板中的Mueller-Hinton肉湯中。將貫葉連翹提取物的兩倍系列稀釋液加入到含有細(xì)菌細(xì)胞的孔中。在37°C培養(yǎng)24小時(shí)后，每個(gè)濃度進(jìn)行三次重復(fù)測(cè)定（n=3）。24小時(shí)后，向每孔加入10μL MTT（5 mg/mL）試劑，并將板在37°C下孵育4小時(shí)。然后，加入DMSO（100μL）終止反應(yīng)，輕輕搖晃板以重新溶解形成的晶體。使用Synergy 4微孔板讀數(shù)儀（BioTek Instruments,Winooski,VT,USA）測(cè)量每孔的吸光度。所有結(jié)果表示為細(xì)胞增殖抑制率，計(jì)算公式為[（A-B）/A]x 100%，其中A和B分別為對(duì)照組和樣品組的平均活菌數(shù)。MIC是抑制任何可見(jiàn)生長(zhǎng)的測(cè)試樣品的最低濃度。
MBC定義為殺死99.9%細(xì)菌接種物的最低濃度，通過(guò)將來(lái)自微孔板各孔的20μL培養(yǎng)物重新接種到Mueller-Hinton瓊脂平板上確定。在37°C培養(yǎng)18小時(shí)后，通過(guò)肉眼觀察瓊脂平板上的細(xì)菌生長(zhǎng)情況確定MBC。所有MIC和MBC測(cè)量至少重復(fù)進(jìn)行兩次。
2.6.時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系測(cè)定
在含有補(bǔ)充了5 mg/mL、10 mg/mL和20 mg/mL貫葉連翹提取物的新鮮制備的Mueller-Hinton肉湯的孔中，接種10^6 CFU/mL的藤黃微球菌，并在37°C培養(yǎng)。每小時(shí)通過(guò)自動(dòng)測(cè)量600 nm處的吸光度（Bioscreen C,Labsystems,Helsinki,Finland）測(cè)定藤黃微球菌細(xì)胞的吸光度。
2.7.貫葉連翹提取物對(duì)藤黃微球菌細(xì)胞蛋白質(zhì)的影響
用貫葉連翹提取物（5 mg/mL、10 mg/mL和15 mg/mL）培養(yǎng)8小時(shí)后，收集藤黃微球菌細(xì)胞（10^6 CFU/mL），并使用超聲波方法提取總蛋白。然后，將樣品與等體積的上樣緩沖液混合，并通過(guò)12%SDS-PAGE進(jìn)行分離。電泳后，用考馬斯亮藍(lán)（CBB）染色蛋白質(zhì)，以檢查藤黃微球菌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)組成。使用odyssey（Li-Cor,USA）對(duì)凝膠進(jìn)行拍照。
2.8.流式細(xì)胞術(shù)
用貫葉連翹提取物（5 mg/mL、10 mg/mL和15 mg/mL）處理藤黃微球菌細(xì)胞。8小時(shí)后，收獲藤黃微球菌細(xì)胞，并根據(jù)制造商的建議（天津華大基因生物技術(shù)有限公司，中國(guó)），在室溫下避光用異硫氰酸熒光素（FITC）-Annexin V和碘化丙啶（PI）染色15分鐘。使用配備CellQuest軟件（BD Biosciences）的流式細(xì)胞儀（FACScan;BD Biosciences）分析細(xì)胞。將細(xì)胞分為活細(xì)胞、壞死細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞。計(jì)算早期和晚期凋亡細(xì)胞的相對(duì)比例以進(jìn)行進(jìn)一步比較。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)超過(guò)三次。
2.9.TUNEL測(cè)定
使用凋亡原位檢測(cè)試劑盒（Promega,Germany），通過(guò)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法，對(duì)凋亡細(xì)胞中DNA片段的3'-OH進(jìn)行標(biāo)記和染色，按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行。使用熒光顯微鏡（Olympus,FV1000,Japan）捕獲熒光素標(biāo)記的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的圖像。此外，TUNEL測(cè)定作為流式細(xì)胞術(shù)的補(bǔ)充方法進(jìn)行，以比單獨(dú)流式細(xì)胞術(shù)更準(zhǔn)確地證明凋亡水平。細(xì)胞核用DAPI（Invitrogen,Molecular Probes,Eugene,OR）標(biāo)記為藍(lán)色，缺口末端標(biāo)記為綠色。細(xì)胞核（藍(lán)色）和缺口末端（綠色）標(biāo)記之間的合并顯示為紫色。
2.10.DNA Laddering測(cè)定
將藤黃微球菌細(xì)胞（10^5 CFU/mL）與貫葉連翹提取物（5 mg/mL、10 mg/mL和15 mg/mL）一起培養(yǎng)8小時(shí)。然后使用凋亡Ladder檢測(cè)試劑盒（Beyotime,China）提取藤黃微球菌細(xì)胞的基因組DNA。然后將DNA在1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并通過(guò)溴化乙錠（EB）染色顯影。在紫外光下對(duì)凝膠進(jìn)行拍照。
2.11.貫葉連翹提取物對(duì)膜電位的影響
將藤黃微球菌細(xì)胞與貫葉連翹提取物（5 mg/mL、10 mg/mL和15 mg/mL）在37°C下培養(yǎng)。八小時(shí)后，收集細(xì)胞，用冷PBS洗滌兩次，用Rhodamine 123（Sigma,Germany）在37°C下染色30分鐘，然后通過(guò)FACScanto（BD Biosciences）進(jìn)行分析。
2.12.統(tǒng)計(jì)分析
所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SE），所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包（SPSS Inc.,Chicago,IL,USA）進(jìn)行。此外，p<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
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