變形鏈球菌的atlA基因編碼一種自溶素，這種自溶素是生物膜成熟和正常細胞表面生物發(fā)生所必需的。我們發(fā)現(xiàn)，這種主要導(dǎo)致齲齒的病原體形成生物膜的能力在通氣環(huán)境中生長時顯著受損，并且暴露于氧氣的細胞顯示出表面蛋白譜的顯著變化。atlA基因的失活緩解了氧氣存在下生物膜形成的抑制。此外，AtlA缺陷菌株特征性的長鏈形成在通氣生長的細胞中不太明顯。SMu0629基因緊鄰atlA上游，編碼一種含有C-X-X-C基序的產(chǎn)物，這是硫醇-二硫鍵氧化還原酶的典型特征。SMu0629的失活顯著降低了AtlA蛋白水平并導(dǎo)致對自溶的抗性。SMu0629突變體在氧氣存在下也顯示出比親本菌株更強的生物膜形成能力。SMu0629的表達被證明受VicRK雙組分系統(tǒng)控制，后者影響變形鏈球菌的氧化應(yīng)激耐受性。vicK的破壞也抑制了AtlA的加工，并且突變體對自溶高度抗性。在好氧條件下生長時，vicK突變體也比UA159菌株顯示出顯著增加的生物膜形成。本研究闡明了AtlA和VicK在協(xié)調(diào)表面生長和包膜生物發(fā)生以響應(yīng)氧化還原條件中的核心作用。
變形鏈球菌被認為是人類齲齒的主要病原體。變形鏈球菌的一個關(guān)鍵毒力特性是它能夠在牙齒表面建立結(jié)構(gòu)和組成復(fù)雜的生物膜的一部分。一旦在某個位置建立，口腔生物膜隨時間保持相對穩(wěn)定，盡管環(huán)境條件不斷變化。在這些環(huán)境挑戰(zhàn)中生存并成為穩(wěn)定口腔生物膜群落中數(shù)量顯著的成員是變形鏈球菌持久性和致齲性的基本要素。最近，我們鑒定了一種表面相關(guān)蛋白（SMu0630），該蛋白是變形鏈球菌UA159正常生物膜形成所必需的。在后續(xù)研究中，該蛋白被揭示為生物膜成熟和細胞自溶所必需的。該基因產(chǎn)物因其自溶活性被命名為AtlA。AtlA是正常細胞表面生物發(fā)生所必需的，因為AtlA缺陷菌株具有顯著減少的可用非離子去污劑提取的表面蛋白補體。此外，AtlA被證明是變形鏈球菌完全表達遺傳能力所必需的。
細菌自溶素能夠水解細胞壁的肽聚糖組分，這是一種高度動態(tài)的結(jié)構(gòu)，隨著細胞生長而擴展，并在細胞分裂或分化時重塑。自溶素通常在整個生長周期中產(chǎn)生，并已被證明在許多關(guān)鍵功能中發(fā)揮核心作用，包括細胞壁更新、細胞生長、抗生素抗性、細胞表面粘附、遺傳能力、蛋白質(zhì)分泌和致病性。自溶素活性的調(diào)節(jié)被認為最常見于翻譯后水平，通過底物構(gòu)象或修飾、通過各種細胞壁結(jié)合域與細胞的差異結(jié)合、細胞壁中酶復(fù)合物的拓撲排列以及輸出位點的控制，盡管自溶素的轉(zhuǎn)錄控制已被證明。在一些革蘭氏陽性細菌中，當(dāng)細胞達到生長穩(wěn)定期晚期時，自溶自發(fā)發(fā)生。這一致命事件被提出為有意義的生物學(xué)現(xiàn)象，因為細胞裂解釋放的DNA有助于自然感受態(tài)細菌的生存和遺傳多樣性。由β-內(nèi)酰胺抗生素引起的不可逆效應(yīng)，如青霉素誘導(dǎo)的細菌溶解，也得到了很好的描述。顯示影響自溶素活性或激活的其他因素包括營養(yǎng)限制、質(zhì)子動勢力以及許多影響細胞壁物理化學(xué)性質(zhì)的因素。
影響牙齒生物膜組成和活性的一個關(guān)鍵環(huán)境因素是氧氣。在人類口腔中，氧氣豐富，但定植于口腔各種表面的生物膜支持多種需氧菌、兼性厭氧菌和專性厭氧細菌。在清潔釉質(zhì)表面發(fā)展口腔生物膜期間，牙菌斑的氧化還原電位下降，牙菌斑的深層被認為是厭氧的。因此，口腔生物膜的氧張力和氧化環(huán)境隨部位和生物膜特性變化很大。毫不奇怪，口腔細菌生物膜具有相對活躍的氧代謝，并已發(fā)展出防御氧氣存在或各種氧化還原環(huán)境的能力。
在當(dāng)前研究中，我們證明了氧氣對變形鏈球菌形成生物膜的能力具有深遠影響，并證明氧氣影響AtlA的表達和成熟，而AtlA對生物膜形成和正常細胞表面生物發(fā)生至關(guān)重要。揭示了氧化環(huán)境、AtlA生物發(fā)生、細胞自溶、雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和變形鏈球菌毒力表達之間聯(lián)系的新見解。
材料與方法
細菌菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基和生長條件。 大腸桿菌DH10B在Luria肉湯中生長，變形鏈球菌UA159及其衍生物在腦心浸液肉湯中生長。遺傳轉(zhuǎn)化后選擇抗生素抗性菌落時，根據(jù)需要向培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素、紅霉素和卡那霉素。對于生物膜形成測定，變形鏈球菌菌株在補充有葡萄糖或蔗糖（終濃度20 mM）的半限定培養(yǎng)基BM中的微孔板中生長?；蚓幪枌?yīng)于Los Alamos口腔病原體網(wǎng)站注釋的編號。
突變菌株的構(gòu)建。 用于缺失誘變的引物如表1所示。為了在SMu0629、vicR和vicK基因中產(chǎn)生缺失，從變形鏈球菌UA159的染色體DNA中擴增每個基因的5'和3'側(cè)翼區(qū)域，使用設(shè)計到每個引物組中的BamHI位點連接在一起，并克隆到pGEM-T Easy載體中。質(zhì)粒用BamHI消化，并與來自pALH124或pVT924的非極性或極性卡那霉素盒連接，用相同酶消化。誘變質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化變形鏈球菌UA159。轉(zhuǎn)化體在含有卡那霉素的BHI瓊脂上選擇，并通過PCR和測序確認每個基因中的雙交換重組。本研究中構(gòu)建的變形鏈球菌突變株列于表2。
生長、生物膜和自溶測定。 為了比較生長速率，用變形鏈球菌過夜培養(yǎng)物的1:100稀釋液接種新鮮培養(yǎng)基。在37°C常規(guī)時間間隔測量600 nm的光密度或使用Bioscreen C實驗室系統(tǒng)監(jiān)測。Bioscreen C系統(tǒng)設(shè)置為每30分鐘搖動15秒。對于厭氧條件，將無菌礦物油覆蓋在培養(yǎng)物上。還通過相差顯微鏡觀察培養(yǎng)物以記錄鏈長，如先前詳細描述。在微孔板中形成穩(wěn)定生物膜的能力如先前描述測量。通過將板在空氣中、含5% CO2的好氧氣氛中靜態(tài)孵育，或在好氧氣氛中以150 rpm在旋轉(zhuǎn)搖床上振蕩，有或無礦物油覆蓋，允許生物膜形成。自溶測定如先前描述進行，略有修改。簡要地，在生長指數(shù)期晚期的變形鏈球菌細胞收獲，用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌兩次。將細胞重懸于含有1 M KCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2和0.4%疊氮化鈉的20 mM磷酸鉀緩沖液（pH 6.5）中，至OD550為0.9。細胞懸浮液在44°C孵育，并使用Bioscreen C實驗室系統(tǒng)監(jiān)測細胞懸浮液的OD550來自溶。
相關(guān)新聞推薦
3、復(fù)雜氧化銅礦堿性浸礦菌種的選育及浸出規(guī)律研究