摘要
洋蔥伯克霍爾德菌及伯克霍爾德菌復(fù)合體（BCC）的其他成員是高度多重耐藥的細(xì)菌，可引起囊性纖維化患者的嚴(yán)重肺部感染。對(duì)2686種來(lái)源于海洋生物的化合物進(jìn)行篩選，鑒定出能與多粘菌素B（PMB）協(xié)同抑制洋蔥伯克霍爾德菌生長(zhǎng)的分子。在1μg/mL濃度下，五種化合物與PMB協(xié)同作用，使洋蔥伯克霍爾德菌的生長(zhǎng)抑制≥70%，相比單獨(dú)使用PMB。后續(xù)測(cè)試顯示，篩選中的一種化合物，氨基香豆素抗生素新生霉素，與PMB和粘菌素協(xié)同作用，對(duì)抗妥布霉素耐藥的臨床分離株洋蔥伯克霍爾德菌和多重伯克霍爾德菌。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)新生霉素敏感性在BCC物種中常見(jiàn)，且這些細(xì)菌對(duì)另一種氨基香豆素氯新生霉素更敏感，后者與PMB對(duì)洋蔥伯克霍爾德菌也具有相加效應(yīng)。這些研究支持使用氨基香豆素抗生素治療BCC感染，并表明可以找到協(xié)同劑來(lái)增強(qiáng)抗微生物肽和多粘菌素對(duì)BCC細(xì)菌的效力。
1.引言
多重耐藥性的驚人增加，特別是內(nèi)在的高水平耐藥性，削弱了改善慢性病患者健康和延長(zhǎng)壽命的新治療方法。例如，囊性纖維化（CF）患者慢性肺部細(xì)菌感染導(dǎo)致的呼吸衰竭阻礙了過(guò)去幾十年生存率的提高，并且仍然是主要死因。內(nèi)在多重耐藥的CF病原體不斷出現(xiàn)，如伯克霍爾德菌復(fù)合體（BCC）細(xì)菌、嗜麥芽窄食單胞菌、木糖氧化無(wú)色桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，這迫切需求新療法。多重耐藥細(xì)菌數(shù)量的增長(zhǎng)，以及缺乏新抗生素來(lái)對(duì)抗它們，導(dǎo)致多粘菌素（一類脂聯(lián)抗微生物肽（AMPs））的復(fù)興，作為最后手段的治療，盡管先前報(bào)道了其全身毒性。不幸的是，BCC細(xì)菌也對(duì)這類化合物耐藥。我們研究了治療策略，以破壞BCC的高水平內(nèi)在多重耐藥性，使用洋蔥伯克霍爾德菌作為模型細(xì)菌。洋蔥伯克霍爾德菌是一種環(huán)境機(jī)會(huì)病原體，屬于BCC，可引起CF患者的嚴(yán)重呼吸道感染。這些感染與肺功能更快下降、debilitating exacerbations和最終死亡相關(guān)，并且它們還降低了CF患者肺移植后的生存率。
抗微生物佐劑是抑制細(xì)菌抗生素耐藥機(jī)制的分子，有效增加細(xì)菌對(duì)該抗生素的敏感性。這一概念已被研究作為逆轉(zhuǎn)細(xì)菌抗生素耐藥性的有吸引力的方法。在這里，我們使用一種策略，通過(guò)篩選來(lái)源于海洋的天然分子庫(kù)，鑒定與多粘菌素B（PMB）協(xié)同對(duì)抗洋蔥伯克霍爾德菌的化合物。這些協(xié)同劑降低了洋蔥伯克霍爾德菌和其他BCC細(xì)菌對(duì)PMB和粘菌素（多粘菌素E）的極端耐藥性，從而提高了它們的抗微生物有效性。臨床上，這可以提供一種有效的方法來(lái)減少多粘菌素的劑量，從而提高其療效，同時(shí)克服其毒性作用。
2.材料和方法
2.1.細(xì)菌菌株
洋蔥伯克霍爾德菌K56-2用于初始篩選；該分離株來(lái)自CF患者，是洋蔥伯克霍爾德菌ET-12流行克隆譜系的常用原型菌株。后續(xù)研究使用先前描述的BCC菌株組以及兩株妥布霉素耐藥的洋蔥伯克霍爾德菌CF分離株（GIB-C1141144和GRI-C1210932）。
2.2.篩選化合物庫(kù)以尋找與多粘菌素B的協(xié)同作用
該庫(kù)包含2686種來(lái)源于海洋生物的化合物，由Biomar Microbial Technologies（萊昂，西班牙）分離和表征。這些化合物的溶液被接種到一對(duì)100孔Bioscreen C板（Growth Curves USA,Piscataway,NJ）中，溶劑被蒸發(fā)。洋蔥伯克霍爾德菌K56-2的過(guò)夜培養(yǎng)物在新鮮LB肉湯（Becton Dickinson&Co.,Franklin Lakes,NJ）中稀釋至600nm光密度（OD600）為0.0002，并加入板中（300μL/孔），溶解化合物至最終濃度1μg/mL。板對(duì)在Bioscreen C自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀（Oy Growth Curves AB Ltd.,Helsinki,Finland）中于37°C連續(xù)中等振蕩培養(yǎng)。
2小時(shí)后，PMB以最終濃度500μg/mL加入一個(gè)板中，而PMB溶解的載體對(duì)照（0.2%牛血清白蛋白和0.01%乙酸）加入另一個(gè)板中。該P(yáng)MB濃度對(duì)洋蔥伯克霍爾德菌K56-2的生長(zhǎng)影響很?。〝?shù)據(jù)未顯示）。每對(duì)板中也包含無(wú)化合物的孔。板進(jìn)一步在37°C孵育，每30分鐘讀取OD600。此外，每板有一個(gè)孔無(wú)化合物，接收無(wú)菌LB加載體對(duì)照或PMB，作為陰性對(duì)照，并確認(rèn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)允許鑒定對(duì)洋蔥伯克霍爾德菌有直接抗微生物活性的化合物以及與PMB協(xié)同的化合物。
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