由于bfmA和bfmK組織在一個操縱子中，bfmK（ΔSmlt4208）的插入失活可能對整個操縱子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生極性效應(yīng)。為避免此缺陷，使用自殺載體pK18mobsacB通過同源雙交換方法構(gòu)建了bfmA和bfmK的框內(nèi)缺失突變體（IFD-bfmA和IFD-bfmK）。同時，將全長bfmA和bfmK序列PCR擴增并插入廣宿主范圍載體pBBRMCS2的多克隆位點，構(gòu)建兩個重組載體。然后將重組載體轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的突變體中以遺傳互補突變（分別為菌株IFD-bfmA-bfmA和IFD-bfmK-bfmK）。在這兩個構(gòu)建體中，載體攜帶的bfmA和bfmK處于PlacZ啟動子的控制下。測試了這些菌株的生物膜形成能力。如圖4D所示，IFD-bfmA和IFD-bfmK突變體的生物膜量分別顯著降低至野生型菌株水平的61%和53%，而遺傳互補幾乎完全抑制了由基因缺失引起的影響。還確定了這些菌株的細菌生長（圖4E），結(jié)果顯示bfmA和bfmK的框內(nèi)缺失突變體以及互補的IFD-bfmK-bfmK菌株與野生型菌株生長相同?；パa的IFD-bfmA-bfmA菌株比其他菌株生長更慢，這可能是由bfmA的過表達引起的，因為在其轉(zhuǎn)錄的Plac啟動子在被測試的生長條件下具有高活性。這一結(jié)果再次排除了突變體中生物膜形成減少是由細菌生長緩慢引起的可能性。此外，bfmA和bfmK突變體的鞭毛、細胞外蛋白酶和淀粉酶活性以及對多種抗生素的敏感性沒有顯著改變（數(shù)據(jù)未顯示）。綜上所述，以上分析表明TCS BfmA-BfmK控制嗜麥芽窄食單胞菌中的生物膜發(fā)育。
使用ChIP篩選BfmA調(diào)控的下游基因
BfmA-BfmK TCS的調(diào)控子此前未被研究。我們使用STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測了BfmA和BfmK可能的功能伙伴。根據(jù)基因組鄰接、共現(xiàn)或不同物種中的基因融合事件等信息判斷，BfmK和BfmA各自可能與10個蛋白質(zhì)存在相互作用（評分>0.850）（見補充材料中的圖S3A和B），其中三個是其他HKs（Smlt0977[PhoR]、RpfC[Smlt2234]和SmeS[Smlt4477]）。這些蛋白質(zhì)中的六對，即PhoB-PhoR、Smlt1218-Smlt1219、Smlt1540-Smlt1541、Smlt3944-Smlt3949、SmeS-SmeR和BfmA-BfmK，它們本身在基因組中成簇分布，表明與TCS BfmA-BfmK有很強的功能關(guān)聯(lián)。
由于BfmA是一個典型的OmpR家族RR，其C端輸出結(jié)構(gòu)域是一個轉(zhuǎn)錄因子（TF）區(qū)域（151至228個氨基酸），我們推測這些相關(guān)蛋白編碼基因中的一些在轉(zhuǎn)錄水平上受BfmA直接調(diào)控。因此，我們通過DOOR數(shù)據(jù)庫預(yù)測了這些相互作用蛋白編碼基因的15個操縱子結(jié)構(gòu)，并根據(jù)這些操縱子的預(yù)測啟動子區(qū)域設(shè)計了PCR引物（見補充材料中的圖S3C）。隨后使用ChIP結(jié)合半定量PCR來篩選可能與TF BfmA結(jié)合的DNA。為進行此實驗，我們構(gòu)建了另一個bfmA互補菌株，類似于IFD-bfmA-bfmA菌株，但在bfmA序列的終止密碼子5'端添加了His6表位標簽編碼序列。將該DNA插入片段克隆到pBBRMCS2載體中，用于互補bfmA突變體（菌株IFD-bfmA-bfmA）。使用針對BfmA-His6的單克隆抗體，基于該重組菌株（IFD-bfmA-bfmA）進行ChIP。如圖5A所示，即使使用輸入DNA樣品作為DNA加樣對照，也無法通過PCR擴增出PSmlt1216、PSmlt1423、PSmlt3944和PSmlt4477的啟動子區(qū)域，表明這些順式調(diào)控序列存在顯著的遺傳多態(tài)性。此外，PSmlt1436、PSmlt1540、PSmlt2233、PSmlt2700和PSmlt2801的PCR產(chǎn)物在樣品中缺失，表明這些啟動子不與BfmA結(jié)合。因此，上述九個啟動子區(qū)域被排除在后續(xù)分析之外。然而，與使用來自缺乏His6標簽的IFD-bfmA-bfmA對照菌株的共免疫沉淀DNA進行PCR擴增的背景對照相比，來自IFD-bfmA-bfmA*ChIP樣品的PSmlt0570、PSmlt0800、PSmlt0978、PSmlt3568、PSmlt3949和PSmlt4209的PCR產(chǎn)物量顯著增加（圖5A），表明BfmA-His6在體內(nèi)直接結(jié)合這些啟動子區(qū)域，相應(yīng)的基因或操縱子受BfmA調(diào)控。
bfmA正向調(diào)控其自身操縱子和Smlt0800的轉(zhuǎn)錄
為了評估BfmA對其下游候選基因的調(diào)控效果，我們選擇了六個啟動子區(qū)域可被BfmA結(jié)合的操縱子，并通過半定量RT-PCR比較了野生型菌株和IFD-bfmA突變體中mRNA的量。如圖5B所示，未觀察到代表性基因Smlt3949和Smlt3568的陽性擴增條帶，表明在本研究使用的生長條件下它們的轉(zhuǎn)錄水平太低而無法檢測到。Smlt0570和Smlt0978的mRNA量在測試的菌株中保持穩(wěn)定（圖5B），定量實時PCR也顯示它們的mRNA水平在野生型菌株和bfmA突變體之間相似（見補充材料中的圖S4）。這些結(jié)果表明，盡管存在TF-啟動子結(jié)合事件，這兩個基因的轉(zhuǎn)錄與BfmA的控制無關(guān)。Smlt0800和bfmK的轉(zhuǎn)錄水平在IFD-bfmA突變體中顯著降低，而bfmA的遺傳互補將其轉(zhuǎn)錄水平恢復(fù)至接近或高于野生型水平，表明BfmA作為正向調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)它們的表達。
為了驗證上述結(jié)果，采用定量實時PCR比較Smlt0800和bfmK的mRNA量。獲得的結(jié)果與半定量RT-PCR測定結(jié)果非常吻合（圖5C）；bfmA的框內(nèi)缺失導(dǎo)致Smlt0800和bfmA的mRNA量分別減少60%和96%，并且這些減少幾乎完全被突變體中bfmA的遺傳互補所抑制（圖5C）。綜上所述，結(jié)果表明bfmA正向自動調(diào)節(jié)其自身操縱子的轉(zhuǎn)錄。此外，BfmA也是一個正向調(diào)節(jié)因子，控制Smlt0800的轉(zhuǎn)錄，該基因編碼一種參與?；?CoA水解的?；?CoA硫酯酶（命名為AcoT）。
BfmA結(jié)合acoT的啟動子區(qū)域以調(diào)控其表達和生物膜
為了驗證體內(nèi)ChIP-PCR結(jié)果并確定BfmA是否具有雙鏈DNA結(jié)合活性，通過PCR擴增了bfmA-bfmK操縱子和acoT啟動子區(qū)域的200 bp序列，用T4多核苷酸激酶和[γ-32P]ATP進行末端標記，并用作體外EMSA的探針。如圖6A和B所示，BfmA重組蛋白與標記的PbfmA和PSmlt0800 DNA探針形成了穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。BfmA與兩種探針的結(jié)合事件是特異性的，因為加入濃度遞增的未標記DNA探針逐漸與32P標記的探針競爭，導(dǎo)致同位素信號減弱或完全消失。綜上所述，體外和體內(nèi)證據(jù)支持BfmA直接結(jié)合acoT和bfmA-bfmA操縱子的啟動子區(qū)域并正向控制其轉(zhuǎn)錄的論斷。
為了評估BfmA調(diào)控的acoT表達是否與生物膜相關(guān)，構(gòu)建了acoT的框內(nèi)缺失突變體（IFD-acoT）。如圖6C所示，acoT的缺失導(dǎo)致細菌細胞聚集顯著減少（38%）。雖然通過全長acoT基因進行遺傳互補（菌株IFD-acoT-acoT）并未完全將缺陷恢復(fù)至野生型水平，但確實使突變體的細菌生物膜顯著增加。此外，當acoT在bfmA突變體（菌株IFD-bfmA-acoT）中過表達時，由bfmA突變引起的生物膜缺陷被顯著抑制，盡管未完全恢復(fù)。這些遺傳實驗表明acoT也參與生物膜發(fā)育，并且acoT轉(zhuǎn)錄減少是bfmA突變體生物膜缺陷的原因之一。
討論
HKs是細菌用于檢測環(huán)境刺激的主要細胞傳感器；因此，它們被認為是開發(fā)新型抗生素化學品的候選分子靶點。基于對HK基因特征（62個基因）的生物信息學預(yù)測（圖1），本研究成功構(gòu)建了醫(yī)院感染病原體嗜麥芽窄食單胞菌的51個HK基因突變體，并鑒定出許多在以下方面存在表型缺陷的突變體：菌落形態(tài)、細菌在半固體培養(yǎng)基上的游動能力以及在聚苯乙烯表面的生物膜形成（圖2和3）。在這些HK基因中，分子分析揭示了一個TCS，即BfmA-BfmK（Smlt4209-Smlt4208），控制生物膜發(fā)育（圖4D）?；诒狙芯渴占纳锘瘜W證據(jù)，BfmK是一個具有自動激酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的HK（圖4C），而BfmA是一個在體外和體內(nèi)能夠結(jié)合雙鏈DNA的轉(zhuǎn)錄因子（圖5和6）。通過STRING數(shù)據(jù)庫搜索預(yù)測BfmA-BfmK系統(tǒng)可能的功能伙伴后，隨后的ChIP-PCR篩選鑒定出六個被BfmA結(jié)合的啟動子。定量實時PCR和EMSA表明，BfmA直接結(jié)合bfmA-bfmK操縱子和一個?；?CoA硫酯酶編碼基因（acoT,Smlt0800）的5'順式調(diào)控序列，并正向調(diào)節(jié)它們的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果表明BfmA-BfmK TCS具有自動調(diào)節(jié)功能，并控制acoT的mRNA水平，而acoT被證明參與生物膜形成（圖6C）。據(jù)我們所知，這是首個系統(tǒng)研究嗜麥芽窄食單胞菌中TCS生物學功能的研究。它將促進我們未來旨在對抗這種細菌病原體引起的致命感染的研究。
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