結(jié)果


嗜麥芽窄食單胞菌編碼具有多種結(jié)構(gòu)域組成的組氨酸激酶。由于嗜麥芽窄食單胞菌ATCC 13637的完整基因組尚未測(cè)序，本研究使用嗜麥芽窄食單胞菌K279a基因組作為參考基因組。根據(jù)原核雙組分系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)，該基因組包含60個(gè)HK基因，其中16個(gè)是混合HK類型，每個(gè)都包含一個(gè)額外的接收器結(jié)構(gòu)域作為磷酸化接受體。獨(dú)立的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索還顯示Smlt2710是一個(gè)HWE HK（一組在假定的N和G1框內(nèi)分別具有特征性His和Trp-Glu殘基的HK組）。此外，Smlt4131含有一個(gè)具有保守N、G1和G2框的ATP酶結(jié)構(gòu)域，但缺乏典型的HK H框，表明它是一個(gè)退化的HK。Smlt2710和Smlt4131也被納入分析，因此本研究共檢查了嗜麥芽窄食單胞菌的62個(gè)推定的HK基因（圖1）。

與嗜麥芽窄食單胞菌近緣的黃單胞菌屬成員的HK基因比較顯示，黃單胞菌屬中與毒力相關(guān)的HKs的所有直系同源物，包括RpfC（Smlt2234）、VgrS（或ColS,Smlt3765）、PhoQ（Smlt0278）、RavS（Smlt2324）、RavA（Smlt2322）、RaxH（Smlt3567）和HpaS（Smlt4106），也存在于嗜麥芽窄食單胞菌K279a中（圖1）。由于嗜麥芽窄食單胞菌不是植物病原體，這些與毒力相關(guān)的HKs在兩個(gè)細(xì)菌類群（窄食單胞菌屬和黃單胞菌屬）之間的信號(hào)檢測(cè)方面可能表現(xiàn)出細(xì)微的功能分化。這些HK基因中的大多數(shù)（56個(gè)基因）在基因組附近至少含有一個(gè)RR基因。例外是Smlt0107、Smlt0570、Smlt3019、Smlt3625、Smlt3730和Smlt4540；這六個(gè)HKs是孤兒，其同源RRs可能缺失或位于其他基因組位點(diǎn)上。


HK基因的系統(tǒng)插入失活和突變體的表型表征。為了獲得嗜麥芽窄食單胞菌ATCC 13637中HK基因的突變體文庫(kù)，我們最初旨在構(gòu)建包含HK基因截短DNA序列（300至450 bp）作為插入片段的重組自殺載體（pK18mob）。在嗜麥芽窄食單胞菌K279a基因組中預(yù)測(cè)為HKs的62個(gè)基因中，獲得了60個(gè)重組載體（見(jiàn)補(bǔ)充材料中的圖S1）。兩個(gè)基因，Smlt1219和Smlt4540，未能通過(guò)各種引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，表明它們不存在于嗜麥芽窄食單胞菌ATCC 13637基因組中。從這些自殺載體開(kāi)始，共獲得了51個(gè)插入突變體，并通過(guò)PCR進(jìn)行了驗(yàn)證（表1）。盡管付出了巨大努力，但11個(gè)基因（Smlt1219,Smlt1437,Smlt1541,Smlt2322[ravA],Smlt2382,Smlt2646,Smlt3765[vgrS],Smlt3948,Smlt4131,Smlt4540,和Smlt4627）被證明很難敲除。這些基因在嗜麥芽窄食單胞菌ATCC 13637中可能是必需的，或者它們的失活可能導(dǎo)致在本研究使用的培養(yǎng)條件下嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷。

在豐富NYG平板（1.5%瓊脂）和半固體NYG平板（0.1%瓊脂）上分別觀察了HK基因突變體的菌落形態(tài)和游動(dòng)性（圖2），并測(cè)量了所有突變體在NYG培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線（見(jiàn)補(bǔ)充材料中的圖S2）。五個(gè)基因（Smlt0769,Smlt0882,Smlt0977,Smlt1636,和Smlt1785）的突變體比野生型菌株或其他突變體生長(zhǎng)顯著緩慢（見(jiàn)補(bǔ)充材料中的圖S2）。Smlt0882是腸桿菌莢膜合成中RcsC的直系同源物。RcsC HK調(diào)節(jié)細(xì)菌包膜應(yīng)激反應(yīng)，其突變通常影響細(xì)胞包膜完整性。Smlt1636在其他細(xì)菌中的直系同源物尚未被研究。然而，這兩個(gè)基因（Smlt0882和Smlt1636）的失活也降低了細(xì)菌的游動(dòng)能力（圖2C），這可能是由它們緩慢的生長(zhǎng)速率引起的。圖2C和補(bǔ)充材料中的表S1顯示，除了這兩個(gè)基因突變體外，還有其他七個(gè)突變體也表現(xiàn)出游動(dòng)能力下降；它們是Smlt1785、Smlt2260(cheA)、Smlt2267(cheA2)、Smlt2324(ravS)、Smlt2380、Smlt2710和Smlt3944突變體。在這些基因產(chǎn)物中，Smlt2260和Smlt2267分別是大腸桿菌生物傳感器CheA和CheA2的直系同源物，表明它們參與趨化性調(diào)節(jié)。Smlt2324(RavS)、Smlt2380、Smlt2710和Smlt3944是含有PAS結(jié)構(gòu)域的HKs，負(fù)責(zé)檢測(cè)氧氣、氧化還原電位或光，從而表明這些信號(hào)對(duì)嗜麥芽窄食單胞菌的游動(dòng)性至關(guān)重要。

嗜麥芽窄食單胞菌生物膜缺陷突變體的系統(tǒng)篩選。為了研究HK基因突變體的生物膜形成能力，收集在豐富NYG培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞并洗滌，將各自的濃度調(diào)整至OD???為0.4。將等體積的細(xì)菌培養(yǎng)物（20微升）接種到每個(gè)孔含有180微升新鮮NYG培養(yǎng)基的96孔板中。然后將板在28°C孵育5小時(shí)，并使用傳統(tǒng)的結(jié)晶紫染色法計(jì)算生物膜量（圖3A）。同時(shí)，通過(guò)測(cè)定每種培養(yǎng)物的OD???吸光度值來(lái)估計(jì)孔中的細(xì)菌生長(zhǎng)（圖3B）。為了估計(jì)相對(duì)于細(xì)菌生長(zhǎng)的生物膜形成，計(jì)算了生物膜量與浮游細(xì)菌（OD???）的比率（圖3C）。結(jié)果顯示，突變體（ΔSmlt0596,ΔSmlt0884,ΔSmlt3625,和ΔSmlt4477）的生物膜與生長(zhǎng)比率與野生型菌株相比沒(méi)有顯著改變。


九個(gè)突變體（ΔSmlt0158,ΔSmlt0595,ΔSmlt0882,ΔSmlt1421,ΔSmlt1636,ΔSmlt1785,ΔSmlt2380,ΔSmlt2710,和ΔSmlt3944）的生物膜與生長(zhǎng)比率顯著增加，而其他38個(gè)突變體的比率降低。特別值得注意的是，Smlt4208（命名為BfmK）的插入失活導(dǎo)致生物膜顯著減少，這在我們之前使用隨機(jī)、大規(guī)模轉(zhuǎn)座子突變的研究中也觀察到。有趣的是，雖然rpfC直系同源物（Smlt2234）的插入失活導(dǎo)致生物膜與生長(zhǎng)比率顯著降低（圖3C），但其不考慮生長(zhǎng)的生物膜量并未減少（圖3A）。這與黃單胞菌屬成員的情況截然不同，后者的rpfC基因突變已被證明會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間通訊和生物膜形成的明顯缺陷。


Smlt4209-Smlt4208是一個(gè)控制生物膜形成的TCS。我們接下來(lái)專注于進(jìn)一步研究Smlt4208，因?yàn)槠渫蛔凅w穩(wěn)定地?fù)p害了生物膜形成而不影響生長(zhǎng)。此外，之前沒(méi)有研究過(guò)該HK基因的其他直系同源物。如圖4A所示，Smlt4208位于一個(gè)基因組位點(diǎn)，該位點(diǎn)包含一個(gè)RR基因（Smlt4209）、一個(gè)編碼推定的MarR家族轉(zhuǎn)錄因子的基因（Smlt4207）和幾個(gè)功能未知的基因。我們使用不同算法進(jìn)行的操縱子預(yù)測(cè)存在爭(zhēng)議：ProOpDB預(yù)測(cè)Smlt4205-Smlt4209形成一個(gè)包含五個(gè)基因的操縱子，從Smlt4205到Smlt4209，而DOOR數(shù)據(jù)庫(kù)的理論預(yù)測(cè)和MicrobesOnline操縱子預(yù)測(cè)工具都提出一個(gè)僅包含Smlt4208和Smlt4209的操縱子。為了通過(guò)實(shí)驗(yàn)解讀該位點(diǎn)的潛在操縱子結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了一系列引物，并使用RT-PCR檢查這些基因之間的基因間轉(zhuǎn)錄。RT-PCR分析顯示，Smlt4208和Smlt4209確實(shí)構(gòu)成一個(gè)雙順?lè)醋硬倏v子，因?yàn)槲覀冇^察到兩個(gè)基因之間PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增，這表明它們形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元并構(gòu)成一個(gè)完整的TCS（圖4B）。然而，該分析未能檢測(cè)到Smlt4207和Smlt4208之間的轉(zhuǎn)錄，表明Smlt4207是基因組中的一個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單位。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果因此支持了DOOR數(shù)據(jù)庫(kù)和MicrobesOnline操縱子預(yù)測(cè)工具的理論預(yù)測(cè)。因此，我們將該TCS命名為BfmA（Smlt4209）-BfmK（Smlt4208）。

為了驗(yàn)證BfmK和BfmA是否構(gòu)成一個(gè)功能性的TCS，使用pET30a和pET28a分別在大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞中表達(dá)全長(zhǎng)BfmA和BfmK蛋白。此外，還在對(duì)應(yīng)于BfmA和BfmK蛋白磷酸化位點(diǎn)的遺傳密碼中創(chuàng)建了點(diǎn)突變，這些修飾的基因用于表達(dá)重組BfmA（D55A）和BfmK（H237A）蛋白。可溶性BfmA蛋白（純度>98%）、BfmK的反向膜囊泡（BfmK比例>20%）及其重組突變體通過(guò)Ni-NTA親和層析成功表達(dá)和純化（圖4C）。對(duì)重組蛋白進(jìn)行的體外磷酸化測(cè)定顯示，全長(zhǎng)BfmK反向膜囊泡能夠使其保守的His-237位點(diǎn)自動(dòng)磷酸化，而其重組形式BfmK（H237A）未能被磷酸化（圖4C）。這一結(jié)果表明BfmK是一個(gè)具有自動(dòng)激酶活性的典型HK。當(dāng)BfmA被加入反應(yīng)混合物時(shí)，雖然未觀察到代表磷酸化BfmA（BfmA-P）的條帶，但BfmK-P的磷酸化水平降至對(duì)照的約80%。加入BfmA（D55A）蛋白并未降低BfmK-P的水平（圖4C）。這一結(jié)果表明BfmK可以磷酸化其同源BfmA，但BfmA-P可能不穩(wěn)定，半衰期太短而無(wú)法檢測(cè)到。



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