土壤理化性質(zhì)分析
土壤含水量的測定方法是將10 g土壤在105℃下烘干。使用pH計(jì)測定每個樣本的pH值，土壤與去離子水的混合比例為1:2.5。土壤總有機(jī)碳含量使用自動元素分析儀（Vario TOC cube,Elementar,Germany）測定。土壤總氮含量使用自動凱氏定氮儀測定（NA1500，F(xiàn)isons Instruments,Milano,Italy）。土壤總磷含量采用鉬銻比色法測定。土壤總鉀含量使用火焰光度法測定。土壤中的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮濃度使用2 M KCl溶液浸提，土壤與溶液的比例為1:5。隨后，分別使用靛酚藍(lán)法和氯化釩分光光度法測定KCl提取液中的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮濃度。堿性和酸性土壤中的有效磷含量分別采用Olsen法和Bray法測定。土壤質(zhì)地使用激光粒度分析儀（LS-909,OMEC Instruments Co.,Ltd）測定。根據(jù)先前研究提出的標(biāo)準(zhǔn)，土壤顆粒分為黏粒（0~2μm）、粉粒（2~50μm）和砂粒（50~2000μm）。
土壤核酸提取
使用DNeasy PowerSoil Pro試劑盒（Qiagen,Hilden,Germany）從0.50 g鮮土中提取總DNA。此外，分別使用堿性緩沖液洗滌、DNA酶消化和PMA處理提取土壤胞內(nèi)DNA。除DNA外，使用RNeasy PowerSoil Total RNA試劑盒（Qiagen,Hilden,Germany）提取總RNA。我們使用總DNA作為參考，評估不同方法對土壤胞外和胞內(nèi)DNA多樣性分析的影響。堿性緩沖液洗滌方法按照已有方法進(jìn)行。簡而言之，將500μL PBS緩沖液（0.12 M；pH 7.4）和0.50 g新鮮土壤加入微量離心管中，水平搖動30 min（100 rpm）。隨后，將懸濁液在7500×g下離心30 min（4℃），棄上清。重復(fù)此過程兩次后，使用DNeasy Power Soil Pro試劑盒提取殘留土壤中的胞內(nèi)DNA。PMA處理按照已有的方法進(jìn)行，并稍作修改。PMA染料的濃度和處理時間基于先前研究優(yōu)化，以確保有效去除胞外DNA。
具體而言，PMA溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，溶劑體積為500μL，最終PMA濃度為40μM。將該溶液加入0.50 g新鮮土壤中，混合物在室溫下避光孵育5 min，并輕輕旋轉(zhuǎn)。隨后，將試管水平放置在冰盒上，并使用懸掛的650 W鹵素?zé)粼诰嚯x試管20 cm處進(jìn)行四次連續(xù)的光暗循環(huán)，每次30 s。此后，將試管在10,000×g下離心2 min，棄上清。最后，使用DNeasy Power Soil Pro試劑盒從殘留土壤中提取胞內(nèi)DNA。DNase預(yù)消化法按照最近研究的描述進(jìn)行。反應(yīng)混合物包括80μL DNase I（Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA）、805μL無核酸酶水、10μL MgCl2（1 M）、5μL牛血清白蛋白（10 mg/mL）、100μL Tris-HCl（0.5 M；pH=7.5）和0.50 g新鮮土壤。將試管在37℃下水平孵育60 min，搖動速度為100 rpm。隨后，向每管加入50μL 0.5 M EDTA，并在75°C下孵育10 min以終止DNase反應(yīng)。之后，將試管在12,000×g下離心20 min，棄去上清液。最后，使用DNeasy Power Soil Pro試劑盒提取殘留土壤中的胞內(nèi)DNA。使用RNeasy Power Soil Total RNA試劑盒從2.0 g冷凍土壤中提取RNA，通過加入1μL DNase I（Qiagen,Hilden,Germany,10 U）、10μL 10×DNase Buffer去除90μL RNA提取物中的DNA殘留。反應(yīng)在37°C下孵育30 min以確保有效去除DNA。隨后以總RNA作為模板，使用PrimeScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara BioInc.,Shiga,Japan）合成cDNA。反應(yīng)體系包括16μL模板RNA、2μL dNTP Mixture（10 mM）和2μL隨機(jī)六聚體（50μM）。在65°C下孵育5 min后，迅速冷卻至冰上。隨后，向反應(yīng)體系中加入8μL 5×PrimeScript II Buffer、1μL RNase Inhibitor（40 U/μL）、2μL PrimeScript I RTase（200 U/μL）和9μL無RNase水。最后，反應(yīng)體系在30°C下孵育10 min，隨后在42°C下孵育60 min，并在95°C下終止5 min。
qPCR和高通量測序
為定量原核生物16S rRNA基因拷貝數(shù)，我們使用LightCycler96實(shí)時PCR系統(tǒng)（Roche,Germany），使用的通用引物為515F（5′-GTG NCA GCM GCC GCG GTA A-3′）和806R（5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′）。在進(jìn)行高通量測序時，使用相同的通用引物擴(kuò)增16S rRNA基因。在土壤微生物群落分析中，最低序列數(shù)為50,000，而在模擬群落實(shí)驗(yàn)中，測序深度為35,000。所有詳細(xì)的PCR條件和生物信息學(xué)分析程序見補(bǔ)充材料的方法部分。
土壤原核生物共現(xiàn)模式分析
原核生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析僅包括出現(xiàn)頻率高于50%（至少在一半樣本中出現(xiàn)）且平均相對多度大于0.01%的ASV。選擇此閾值是為了將分析重點(diǎn)放在采樣中代表性較好的微生物類群上。使用R包WGCNA構(gòu)建Spearman相關(guān)性矩陣，相關(guān)系數(shù)閾值為0.80，F(xiàn)DR調(diào)整后的p值<0.05，以保留共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析中微生物類群之間的強(qiáng)相關(guān)性。使用“igraph”包計(jì)算網(wǎng)絡(luò)屬性，并使用Gephi進(jìn)行可視化。通過計(jì)算自然連通性在移除不同比例節(jié)點(diǎn)時的變化來評估網(wǎng)絡(luò)的魯棒性。網(wǎng)絡(luò)分析方法的詳細(xì)描述，包括節(jié)點(diǎn)分類和生態(tài)學(xué)解釋，見補(bǔ)充方法。土壤原核生物群落構(gòu)建機(jī)制分析在本研究中，我們分別使用中性群落模型（NCM）、修正隨機(jī)性比率（MST）和iCAMP模型來量化基于不同方法的土壤群落構(gòu)建機(jī)制。更多方法細(xì)節(jié)見補(bǔ)充材料方法部分。
基于不同方法的土壤活體原核生物多度和多樣性分析準(zhǔn)確性評估
從上述52個土壤樣本中選擇了8個典型土壤，評估不同方法對土壤活體原核生物多度和多樣性分析的準(zhǔn)確性（圖S14b）。這些土壤通過在121℃下高壓滅菌30 min，隨后在室溫下孵育24 h進(jìn)行滅菌。此過程重復(fù)三次以確保徹底滅菌。我們構(gòu)建了一個由大腸桿菌Escherichia coli（革蘭氏陰性，快速生長）、熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens（革蘭氏陰性，多功能）、脫氮副球菌Paracoccus denitrificans（革蘭氏陰性，反硝化）、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis（革蘭氏陽性，產(chǎn)孢子）和吸水鏈霉菌Paracoccus denitrificans（革蘭氏陽性，絲狀）組成的模擬群落，所有菌株均購自BNCC（BeNa Culture Collection）。這些菌株的詳細(xì)信息見表S7。將模擬群落接種到每份滅菌土壤中，并立即提取總DNA、胞內(nèi)DNA和RNA，具體操作如補(bǔ)充方法所述。我們使用總DNA作為活體原核生物群落的參考，因?yàn)槟M群落由活菌組成。滅菌土壤中可忽略的胞外DNA進(jìn)一步支持總DNA作為活體原核生物群落的可靠標(biāo)記。
隨后，進(jìn)行qPCR和高通量測序，以分別測定土壤原核生物的多度和多樣性，具體如補(bǔ)充方法所述。鑒于接種菌株的序列在所有研究地點(diǎn)中占96%以上，我們隨后的分析僅關(guān)注這5個菌株。
基于不同方法的土壤細(xì)胞外DNA去除效率測定
本研究選擇了一份草地土壤和一份森林土壤，進(jìn)一步評估了不同方法對土壤胞外DNA的去除效率（圖S14c）。使用帶標(biāo)簽引物的的16S rDNA模擬胞外DNA。簡而言之，在標(biāo)簽引物在515F的5′端添加了19bp的人肌動蛋白序列（5′-CAT TGG CAA TGA GCG GTT C-3′）。以從土壤樣本中提取的DNA為模板，使用ACTF-515F和806R生成ACTF標(biāo)記的16S rDNA PCR產(chǎn)物。PCR體系和參數(shù)如補(bǔ)充方法中的描述相同。使用GeneJET凝膠提取試劑盒（Thermo Scientific,Lithuania）純化PCR產(chǎn)物，并使用Nanodrop2000（NanoDrop Technologies,USA）定量。隨后，將ACTF標(biāo)記的16S rDNA擴(kuò)增子（源自每個土壤樣本）以相當(dāng)于該土壤總DNA含量50%的濃度添加到相應(yīng)土壤中。
立即提取總DNA和胞內(nèi)DNA，如前所述，每個樣本四個重復(fù)。然后使用ACTF和806R通過qPCR測定DNA提取物中的ACTF-16S rDNA拷貝數(shù)。在原始土壤所提取的DNA中，基于ACTF和806R未觀察到陽性擴(kuò)增，這很大程度上確保了該方法的可靠性。最終，DNA去除效率計(jì)算為胞內(nèi)DNA中ACTF標(biāo)記的16S rDNA拷貝數(shù)與總DNA中ACTF標(biāo)記的16S rDNA拷貝數(shù)的比值。在本部分實(shí)驗(yàn)中，同樣選擇總DNA作為參考，因?yàn)樗梢蕴崛√砑拥酵寥乐械乃斜粯?biāo)記的胞外DNA，為比較不同方法去除胞外DNA的有效性提供了基準(zhǔn)。
統(tǒng)計(jì)分析
本研究使用重復(fù)測量方差分析（RMANOVA）確定不同研究方法對土壤原核生物多度和多樣性分析的影響。
使用Venn Diagram和UpSet R包識別和可視化了不同核酸提取方法表征的原核生物群落在ASV水平上共有和特有的ASV數(shù)量。使用非度量多維標(biāo)度（NMDS）、主坐標(biāo)分析（PCoA）和置換多元方差分析（PERMANOVA）評估了不同研究方法對土壤原核生物群落結(jié)構(gòu)的影響。使用Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)確定不同活體原核生物研究方法對原核生物類群相對多度的影響，并使用Graphlan（http://gephi.github.io/）進(jìn)一步可視化。類似方法也用于評估不同方法下活體和總體原核生物群落結(jié)構(gòu)的差異。此外，計(jì)算了配對Bray-Curtis距離以進(jìn)行進(jìn)一步分析。使用geosphere包中的“distm”函數(shù)計(jì)算每對采樣點(diǎn)之間的地理距離，然后基于Mantel檢驗(yàn)分析了地理距離與群落組成相似性之間的關(guān)系。使用Mantel檢驗(yàn)計(jì)算環(huán)境因素與原核生物群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。使用結(jié)構(gòu)方程模型探索環(huán)境因素與微生物群落之間的潛在因果關(guān)系。方法細(xì)節(jié)見補(bǔ)充材料方法部分。大多數(shù)統(tǒng)計(jì)分析在R（4.3.2）中進(jìn)行。
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