乳酸乳球菌BirA與bioY基因的結(jié)合
相對(duì)于近親豬鏈球菌的情況，由于存在birA和bioY的重復(fù)基因，bio基因座的基因組背景復(fù)雜（圖8A）。在bioY1啟動(dòng)子區(qū)域前檢測(cè)到推定的BirA1 DNA結(jié)合位點(diǎn)（ACA GTT AAC CTA AAT TTG ATT TTA GGG TTA CTG T）（圖8B）。根據(jù)使用啟動(dòng)子預(yù)測(cè)中性網(wǎng)絡(luò)程序預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)“T”的位置，BirA1結(jié)合位點(diǎn)似乎與“-10”到“-35”啟動(dòng)子區(qū)域重疊（圖8B），表明bioY1的轉(zhuǎn)錄可能受乳酸乳球菌中BirA1負(fù)調(diào)控。
為了測(cè)試預(yù)測(cè)的BirA位點(diǎn)功能（圖8A和9A），進(jìn)行了電泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA），使用純化的BirA1_LL和BirA2_LL（圖9B-D）。EMSA證實(shí)BirA1_LL以劑量依賴性方式有效結(jié)合bioY1探針（圖9B），而缺乏推定的N端DNA結(jié)合基序的BirA2_LL不結(jié)合探針（圖2和9C）。有趣的是，豬鏈球菌bioY（bioY_ss）啟動(dòng)子能夠與乳酸乳球菌BirA1_LL相互作用（圖9D）。在豬鏈球菌BirA的情況下也發(fā)現(xiàn)了類似情況，它也能結(jié)合乳酸乳球菌bioY啟動(dòng)子。因此，我們預(yù)期豬鏈球菌和乳酸乳球菌的bioY和BirA之間存在串?dāng)_。鑒于BirA1和bioY1啟動(dòng)子之間發(fā)生相互作用，而bioY2缺乏預(yù)測(cè)的BirA1結(jié)合位點(diǎn)，探究這種調(diào)控機(jī)制與生物素同化的生理相關(guān)性可能很有意義。
乳酸乳球菌轉(zhuǎn)運(yùn)H-生物素的能力
針對(duì)已解析的BioY結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)建模表明，BioY1_LL（圖10A）和BioY2_LL（圖10B）均由七個(gè)α-螺旋組成，并在整體構(gòu)型上表現(xiàn)出明顯相似性。鑒于乳酸乳球菌編碼兩個(gè)BioY轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，我們假設(shè)它能夠進(jìn)行強(qiáng)大的生物素轉(zhuǎn)運(yùn)。乳酸乳球菌培養(yǎng)物在限制生物素或過(guò)量生物素（1 nM或1μM）存在下生長(zhǎng)4.5小時(shí)，離心沉淀并用PBS洗滌以去除游離生物素，用于3H-生物素轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)定（圖10C,D）。在測(cè)量時(shí)間間隔內(nèi)，生物素耗竭培養(yǎng)物（預(yù)測(cè)產(chǎn)生兩種BioY轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）和生物素充足培養(yǎng)物（預(yù)測(cè)僅需單一轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）的3H-生物素相對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)相似。樣品之間的微小差異僅在初始轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間點(diǎn)觀察到（圖10D）。相反，在一分鐘及以后，生物素的攝取/積累大致相等（圖10C）。似乎測(cè)試的外源生物素增量并未顯著增強(qiáng)生物素?cái)z取活性。
結(jié)論
本文報(bào)告的數(shù)據(jù)表明益生菌細(xì)菌乳酸乳球菌中存在特定的生物素利用途徑（圖1），與其近親動(dòng)物病原體豬鏈球菌在birA和bioY基因座的冗余（和/或重復(fù)事件）上不同（圖8）。乳酸乳球菌預(yù)計(jì)是生物素營(yíng)養(yǎng)缺陷型，因?yàn)樗狈ν暾纳锼厣锖铣赏緩?。與豬鏈球菌中BirA調(diào)控bioY基因轉(zhuǎn)錄的生物素?cái)z取調(diào)控機(jī)制不同，乳酸乳球菌有兩個(gè)負(fù)責(zé)生物素?cái)z取的BioY轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，和兩個(gè)催化蛋白質(zhì)生物素化的BPL酶（BirA1和BirA2_LL）。在兩個(gè)bioY基因（bioY1_LL和bioY2_LL）中，bioY1_LL的轉(zhuǎn)錄似乎受BirA1_LL調(diào)控，而bioY2_LL的表達(dá)是組成型的（圖1）。這種獨(dú)特機(jī)制可能確保乳酸乳球菌具有響應(yīng)環(huán)境和/或胃腸道中波動(dòng)生物素水平的能力。
據(jù)我們所知，細(xì)菌生物素代謝的調(diào)控至少通過(guò)三種不同機(jī)制發(fā)生，分別以大腸桿菌BirA、農(nóng)桿菌BioR和恥垢分枝桿菌BioQ為代表。調(diào)控的生物素轉(zhuǎn)運(yùn)以布魯氏菌BioR22加上副球菌屬12和豬鏈球菌通過(guò)BirA為例。乳酸乳球菌中兩種不同功能性生物素蛋白連接酶的非典型出現(xiàn)增加了細(xì)菌生物素利用獨(dú)特實(shí)例的廣度（圖1）。在弗朗西斯菌屬中，我們也注意到兩個(gè)不同BirA直系同源物的非典型存在。然而，我們未能檢測(cè)到BioY轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的直系同源物，排除了調(diào)控生物素轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性。與弗朗西斯菌屬中雙功能BirA蛋白在體外和體內(nèi)與大腸桿菌bio操縱子發(fā)生串?dāng)_的情況不同，乳酸乳球菌BirA1不能調(diào)控大腸桿菌bio操縱子的表達(dá)（注意：藍(lán)色是由于bio-lacZ融合的明顯表達(dá)，圖5）。值得注意的是，乳酸乳球菌BirA可以與豬鏈球菌bioY基因發(fā)生串?dāng)_（圖9D），反之亦然。與大腸桿菌情況一致，在乳酸乳球菌基因組中檢測(cè)到編碼生物素受體蛋白的accB基因（L0187）（表S1）。乳酸乳球菌兩個(gè)單獨(dú)BirA同源物相對(duì)于單個(gè)大腸桿菌BirA的BPL活性降低（圖6）可能表明BirA_LL的冗余是滿足乳酸乳球菌蛋白質(zhì)生物素化需求所必需的。乳酸乳球菌無(wú)法合成生物素以及胃腸道獨(dú)特生態(tài)系統(tǒng)（充滿各種營(yíng)養(yǎng)元素和競(jìng)爭(zhēng)細(xì)菌）可能選擇了生物素清除途徑的冗余，或者相反，基因組織可能只是細(xì)菌進(jìn)化的遺跡。未來(lái)工作可以探索不同生物素條件下轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白產(chǎn)生的調(diào)控以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白效率的差異。
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