材料與方法
富集培養(yǎng)物
高通量富集培養(yǎng)物（體積1.75 ml）設(shè)置于高壓滅菌的2 ml Fisherbrand 96孔深孔聚丙烯微孔板中?；A(chǔ)培養(yǎng)基包含0.25 g/liter NH4Cl、0.1 g/liter KCl、0.5 g/liter MgSO4·7H2O、0.37 g/liter CaCl2·2H2O、0.25 g/liter NaCl、2.5 g/liter NaHCO3和0.7 g/liter NaH2PO4·H2O，以及維生素和微量元素（按Widdel和Bak所述制備）。基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH使用HCl或NaOH調(diào)整至指定pH后過濾滅菌。調(diào)整至pH 5.5的培養(yǎng)基還包含10 mM嗎啉乙磺酸緩沖液。指示時，基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包含1 g/liter酵母提取物。
各種碳源作為無菌儲備溶液添加到微孔板孔底，最終濃度分別為10 mM葡萄糖、10 mM纖維素、20 mM乳酸、20 mM富馬酸鹽、20 mM丙酮酸鹽、30 mM乙醇、30 mM乙酸鹽、100 mM甲酸鹽或0.5%(體積/體積)堆肥茶。部分富集還使用10 mM乳酸和10 mM富馬酸鹽的混合物。電子受體NaNO3和MgSO4·7H2O也作為無菌儲備溶液添加到微孔板孔底，達到給定最終濃度。環(huán)境相關(guān)金屬（COMM）也使用10 mM無菌醋酸鈾酰溶液和無菌100x金屬混合物溶液（添加到微孔板孔底。對于含COMM的富集，AlK(SO4)2·12H2O粉末以所需濃度懸浮于培養(yǎng)基中，然后加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基至微孔板。
根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH，Al并不總是完全溶解。將基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入含各種添加物的微孔板孔后，每孔接種50至150μl指定ORR地下水樣品或0.1 g指定ORR沉積物樣品。微孔板然后用PHENIX無菌微孔密封膜覆蓋，在22°C黑暗條件下培養(yǎng)。厭氧富集培養(yǎng)在密封厭氧罐中進行，氣氛為20%CO2和80%N2，而微好氧富集類似培養(yǎng)，但氣相含約3%O2，每24小時更換氣體。富集在3個月內(nèi)定期檢查生長。從顯示生長的富集通過劃線接種在固體培養(yǎng)基上或使用豐富LB培養(yǎng)基培養(yǎng)分離菌落獲得分離物。
1x COMM定義為包含1 mM AlK(SO4)2·12H2O、100μM UO2(CH3COO)2、100μM MnCl2·4H2O、100μM NiSO4·6H2O、30μM CoCl2·6H2O、10μM(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O、10μM CuCl2·2H2O和5μM Cd(CH3COO)2·2H2O。COMM中的Al和U分別作為干粉和10 mM過濾無菌儲備溶液單獨加入培養(yǎng)物。其余金屬使用100x過濾無菌儲備溶液加入培養(yǎng)物。該溶液新鮮制備或以單次使用等分試樣儲存于-80°C。指示時，使用COMM的變體，其中Al和/或U被移除或以較低濃度添加。
堆肥茶從ACC商業(yè)堆肥設(shè)施獲取的成品堆肥制備。成品堆肥（1.0 kg）與5升蒸餾水混合，在密封玻璃容器中室溫浸泡4天。resulting堆肥茶在過濾滅菌前用奶酪布過濾，使用Millipore express 0.22μm過濾器。
生長曲線
高通量生長曲線（體積400μl）使用Thermolab Scientific Equipments Bioscreen C自動化微生物生長曲線分析系統(tǒng)進行。對于厭氧生長，Bioscreen C置于Plas Labs硬質(zhì)手套箱中，氣氛為5%H2和95%Ar。生長曲線在22°C下進行，正常速度振蕩，每間隔15秒振蕩，間隔10秒。生長每小時通過600 nm光密度（OD600）監(jiān)測。生長曲線使用與富集實驗相同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加物包括碳源、電子受體和金屬，處理方式相同。每種菌株培養(yǎng)基使用的碳源和pH條件描述于補充材料表S2。所有含指示濃度COMM的生長曲線缺乏Al，因沉淀問題干擾OD讀數(shù)。生長數(shù)據(jù)使用grofit包分析。使用無模型樣條擬合確定每條曲線的生長速率，然后用于擬合劑量響應(yīng)曲線并計算EC50值（如適用）。95%CI使用bootstrap值100確定。生長曲線實驗未添加酵母提取物。
硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶測定
全細胞硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶測定在存在和不存在1x COMM下生長的細胞上進行。對于菌株MT123與COMM生長，U濃度降至10μM而非100μM，因MT123對U敏感。對于測定，細胞在室溫下厭氧培養(yǎng)于50 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含20 mM硝酸鹽和1 g/liter酵母提取物至對數(shù)晚期。每種菌株培養(yǎng)基使用的碳源和pH條件給于表S2。細胞在10,500 xg下收獲10分鐘，然后用5 ml測定緩沖液（50 mM磷酸鉀緩沖液，pH 7.2）洗滌三次，并懸浮于測定緩沖液中使最終OD600值介于0.1和0.4之間。在15 ml Falcon管中，200μl懸浮細胞輕柔混合25μl新鮮制備的0.5 mg/ml甲基紫精和75μl含4 mg/ml連二亞硫酸鈉、4 mg/ml碳酸氫鈉以及100 mM NaNO3（用于硝酸鹽還原酶測定）或1.5 mM NaNO2（用于亞硝酸鹽還原酶測定）的溶液。測定混合物在室溫下孵育5至10分鐘，然后在空氣中渦旋直至溶液變清以停止反應(yīng)。隨后加入1 ml 1%磺胺酸于20%HCl中并渦旋，接著加入1 ml 1.3 mg/ml N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽溶液，形成亞硝酸鹽依賴的偶氮染料呈紅色。測定溶液的OD540和OD420用于測量偶氮染料和光散射吸光度。硝酸鹽還原酶活性以單位/OD660報告，其中單位使用公式100×[OD540?(0.72×OD420)]/(T×V)計算，其中T為時間（分鐘），V為反應(yīng)體積（毫升）。亞硝酸鹽還原酶活性也使用相同方程以任意單位報告，但使用最終測定溶液與無細胞對照之間的OD540變化替代OD540。誤差報告為三個生物學(xué)重復(fù)之間的標(biāo)準偏差。
16S rRNA基因測序
從每種ORR菌株使用ZymoBead基因組DNA試劑盒分離基因組DNA。每種菌株的16S rRNA基因使用EmeraldAmp GT PCR預(yù)混液與引物8F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（ACGGCTACCTTGTTACGACTT）擴增。擴增子由GENEWIZ測序，序列使用核苷酸BLAST分析最接近16S rRNA基因匹配。
匹配16S rRNA基因序列到ORR地下水調(diào)查樣品
16S rRNA基因序列取自先前對93個不同未污染和污染ORR井的地下水調(diào)查。讀段配對合并的rRNA序列從MG-RAST（mgm4554509.3）下載。低質(zhì)量序列（>1預(yù)期錯誤）使用usearch-fastq_filter消除，讀段使用自定義Perl腳本修剪至覆蓋V4引物間區(qū)域。Usearch-fastx_uniques用于計數(shù)每個ESV在每個樣品中出現(xiàn)的次數(shù)。然后ESV按樣品總豐度排名，僅保留前5,000個ESV以減少污染。Usearch-search_exact用于查找分離物16S rRNA序列與100個井V4區(qū)域之間的精確匹配。許多情況下分離物匹配到每個樣品中多個ESV，因此選擇給定井中每個樣品讀段數(shù)最多的匹配ESV。最高百分比豐度計算基于每個樣品的ESV讀段數(shù)除以樣品總讀段數(shù)。僅使用每樣品>1讀段的ESV進行計算和繪圖；然而，所有ESV用于地圖。這些聚合數(shù)據(jù)與每個井的經(jīng)度和緯度結(jié)合到Google Fusion Table中用于地理空間地圖。地圖上豐度低于0.01%的不可定量，僅用于說明目的。
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