摘要
工業(yè)過程和含氮肥料的使用導致硝酸鹽污染環(huán)境，這是一個全球范圍內(nèi)日益嚴重的問題。雖然硝酸鹽可以通過微生物反硝化作用從污染區(qū)域去除，但硝酸鹽經(jīng)常與其他污染物（如重金屬）共存，這些污染物可能阻礙該過程。本文使用與橡樹嶺保護區(qū)（ORR）污染環(huán)境中觀察到的相似濃度的硝酸鹽和金屬（Al、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Cd和U），從ORR的地下水和沉積物中富集和分離了硝酸鹽還原微生物。對七種新的耐金屬硝酸鹽還原菌株進行了表征，并檢查了它們在ORR未污染和污染區(qū)域的分布。雖然這七種菌株具有不同的生長pH范圍、碳源偏好以及對單個和組合金屬的耐受程度，但所有菌株在存在和不存在ORR污染環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的金屬混合物的情況下，都能以相似的速率還原硝酸鹽。通過精確16S RNA序列變異分析，在ORR不同位置的地下水樣品中鑒定出四種菌株，所有四種都出現(xiàn)在未污染和污染區(qū)域。通過使用環(huán)境相關(guān)金屬濃度，我們成功地從ORR未污染和污染環(huán)境中分離出多種微生物，這些微生物能夠在極端混合金屬污染存在下還原硝酸鹽。
硝酸鹽污染是影響地下水質(zhì)量的全球性問題。在某些情況下，地下水同時被硝酸鹽和重金屬混合物污染可能降低微生物介導的硝酸鹽去除，從而延長硝酸鹽污染的持續(xù)時間。本文使用橡樹嶺保護區(qū)污染點存在的金屬和硝酸鹽濃度，分離出七種耐金屬菌株。所有菌株都能在高濃度重金屬混合物存在下還原硝酸鹽。七種菌株中的四種位于橡樹嶺保護區(qū)的原始和污染點。對這些硝酸鹽還原菌株的進一步研究將揭示耐多種金屬的機制，增加我們對硝酸鹽和金屬污染對地下水微生物群落影響的理解。
人為破壞氮循環(huán)是一個日益嚴重的全球性問題，導致了多種環(huán)境和人類健康相關(guān)問題。特別是，氮基肥料和化石燃料使用的增加導致人類活動產(chǎn)生反應(yīng)性氮物種的速率超過了自然過程去除它們的速率。這引發(fā)了一系列負面環(huán)境后果，如沿海富營養(yǎng)化、酸雨以及因硝酸鹽污染導致的地下水質(zhì)量下降。消費硝酸鹽污染的地下水可能引起嬰兒高鐵血紅蛋白血癥，并可能是特定類型癌癥的風險因素。
橡樹嶺保護區(qū)（ORR）位于田納西州，包含一個高度污染的點，同時含有硝酸鹽和多種重金屬。這源于1951年至1983年期間，ORR Y-12工廠的核處理活動將酸性含鈾和硝酸鹽廢物排放到四個容量為950萬升的池塘中。1978年，池塘中的液體pH值范圍為0.8至5.3，硝酸鹽濃度高達74 g/升（1.2 M），同時含有高濃度的各種金屬，包括鋁（4.9 g/升）、錳（0.024 g/升）、鎳（0.13 g/升）以及鈾（0.32 g/升）。1983年，池塘中的液體被中和，resulting污泥沉淀。液體被移除，池塘被覆蓋并改建成停車場。目前有五個大型污染羽流從所謂的S-3池塘延伸出來。周圍地下水中的污染物不僅包括硝酸鹽（高達11.6 g/升，190 mM）和U（140 mg/升），還包括多種金屬，如鋁（560 mg/升）、錳（170 mg/升）和鎳（9.4 mg/升）。因此，ORR S-3池塘是美國在硝酸鹽和金屬污染方面最嚴重的點之一。
硝酸鹽通常通過反硝化作用從土壤和地下水環(huán)境中自然去除，這是一個厭氧或微好氧呼吸過程，微生物將還原電子源的氧化與硝酸鹽的還原耦合，而不是氧氣。形成的亞硝酸鹽隨后被亞硝酸鹽還原酶、一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶分別還原為一氧化氮、一氧化二氮和最終氮氣，盡管許多微生物只執(zhí)行途徑中的某些步驟。硝酸鹽還原酶催化反硝化途徑的第一步，有兩種類型。呼吸硝酸鹽還原酶是一種三聚體跨膜蛋白，由narGHI編碼，需要鉬（Mo）以鉬蝶呤鳥嘌呤二核苷酸（MGD）輔因子形式存在于NarG的活性位點。NarH含有鐵硫簇，而NarI含有細胞色素b。相反，一些生物含有一種二聚體周質(zhì)硝酸鹽還原酶，由napAB編碼。NapA也需要Mo與MGD輔因子配位，NapB含有細胞色素c。
已知幾種環(huán)境因素對土壤中微生物反硝化很重要，包括還原劑來源以及低氧濃度。土壤pH值也會影響反硝化，如果pH值低于6.0，會導致速率降低并形成一氧化二氮作為主要終產(chǎn)物而非氮氣。Mo可用性也影響土壤中硝酸鹽還原。實際上，在ORR硝酸鹽污染點，盡管存在高濃度的各種其他金屬，但一些污染最嚴重的地下水樣品中Mo僅以皮摩爾濃度存在。提出高濃度可溶性Fe和Al在污染環(huán)境中形成沉淀，當酸性污染地下水與周圍土壤混合時。這些沉淀物結(jié)合并吸附鉬酸鹽（Mo的可溶形式），使其無法被微生物用于硝酸鹽還原。
污染環(huán)境中高濃度金屬是另一個可能阻礙硝酸鹽還原的因素。采礦作業(yè)廢水通常含有高濃度金屬（如Fe和Ni）以及硝酸鹽（由于使用硝酸銨基炸藥和氰化物作為浸出劑）。當研究模擬礦水金屬對硝酸鹽去除速率的影響時，發(fā)現(xiàn)50和100 mg/升Ni分別使其降低18%和65%。不銹鋼生產(chǎn)中的酸洗過程導致冶金廢水含有高濃度硝酸鹽和各種金屬（包括Fe、Cr和Ni），這些已測試其對廢水污泥反硝化的影響。發(fā)現(xiàn)Fe（25 mg/升）和Cr（100 mg/升）降低整體反硝化，而Ni（5 mg/升）導致反硝化中間體（NO2-和N2O）積累。此外，在一項鹽沼沉積物研究中，報告稱反硝化速率被多種金屬在1 g/升時降低，包括Pb、Ni、Cr、Zn、Cu、Fe和Cd。結(jié)論是金屬污染可能改變海洋沉積物中氮循環(huán)的動態(tài)。
在ORR的先前研究中，使用16S rRNA、nirK和nirS基因序列調(diào)查了未污染和污染環(huán)境中硝酸鹽還原微生物群落，但未分離關(guān)鍵微生物。在本研究中，我們的目標是表征能夠在極端金屬污染條件下還原硝酸鹽的土著微生物。然后，我們將使用16S rRNA基因序列庫映射這些菌株在93個不同未污染和污染ORR地下水井中的分布。使用基于ORR污染環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的硝酸鹽和金屬混合物濃度，富集并分離出總共七種硝酸鹽還原細菌菌株。所有七種菌株在生長于污染ORR環(huán)境金屬混合物（COMM）存在下保持硝酸鹽還原酶活性，并且通過精確序列變異（ESV）分析，七種菌株中的四種在ORR未污染和污染地下水井中被鑒定。我們提出這些菌株可以作為模型，用于理解在極端污染環(huán)境中高濃度金屬混合物存在下如何減輕硝酸鹽污染。
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