生物膜形成和定量。 使用先前描述的方法在聚苯乙烯表面測(cè)定所有菌株的生物膜形成。為了便于定量和顯微鏡檢查，使用96孔和24孔聚苯乙烯微孔板培養(yǎng)生物膜。通過將5μl過夜培養(yǎng)物的懸浮細(xì)胞接種到96孔微孔板單個(gè)孔中的300 ul SDM培養(yǎng)基中，或?qū)?5μl細(xì)胞懸浮液接種到24孔板中2 ml SDM培養(yǎng)基中來啟動(dòng)生物膜的生長(zhǎng)。然后將微孔板在37°C、5% CO?條件下靜置培養(yǎng)16小時(shí)。孵育后，移除液體培養(yǎng)基，并用無菌蒸餾水沖洗孔一次。將板（96孔）風(fēng)干，并用0.1% 的沙黃染色10分鐘。染色后，用蒸餾水沖洗板以去除多余的染料，并風(fēng)干3小時(shí)。通過使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定微孔板讀數(shù)器（型號(hào)3550；Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.）測(cè)量染色生物膜在490 nm處的吸光度來定量生物膜。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行三次重復(fù)，無生物膜的孔在沙黃染色后用作空白對(duì)照。在24孔板中形成的生物膜在去除浮游細(xì)胞后、染色前立即拍照。
粘附測(cè)定。 測(cè)定菌株粘附到粘蛋白包被的聚苯乙烯表面的能力，以確定單個(gè)基因失活對(duì)初始粘附的影響。聚苯乙烯微孔板的表面首先用2 ml 1% 的豬胃粘蛋白（III型；Sigma）在粘附緩沖液（10 mM KPO?, 50 mM KCl, 1 mM CaCl?, 0.1 mM MgCl?, pH 7.0）中預(yù)處理。將板在室溫下輕輕搖動(dòng)孵育2小時(shí)，移除多余的粘蛋白溶液后風(fēng)干。然后通過加入2 ml預(yù)先制備的靜息細(xì)胞懸浮液（密度為10? 細(xì)胞/ml）開始粘附。靜息細(xì)胞通過離心過夜培養(yǎng)物制備，洗滌兩次，并重懸于粘附緩沖液中。將板在37°C下輕輕搖動(dòng)孵育2小時(shí)。孵育后，移除未粘附的細(xì)胞，并通過輕微超聲處理將粘附細(xì)胞解離到2 ml緩沖液中。對(duì)粘附和非粘附細(xì)胞進(jìn)行活菌落計(jì)數(shù)以確定粘附細(xì)胞的百分比。
酸耐受性測(cè)定。 首先通過評(píng)估在pH 5.0和7.0的THYE瓊脂平板上的生長(zhǎng)來評(píng)估pH對(duì)hk11和rr11缺失突變體的影響。將突變體和親本菌株在THYE肉湯（pH 7.0）中過夜培養(yǎng)。將一份過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到九份新鮮培養(yǎng)基中，并在37°C、5% CO?氣氛中繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。在用于10 mM KPO?緩沖液（pH 7.2）進(jìn)行系列稀釋之前，將培養(yǎng)物輕輕超聲處理15秒以分散細(xì)胞鏈。將每種菌株的細(xì)胞懸浮液等分試樣（20μl）接種到pH 5.0和pH 7.0的THYE瓊脂平板上。然后將板在37°C、5% CO?氣氛中孵育40小時(shí)，然后評(píng)估酸敏感性。通過在pH 5.0的THYE平板上培養(yǎng)40小時(shí)后比較親本和突變體的生長(zhǎng)來確定對(duì)低pH的敏感性。
還在肉湯中培養(yǎng)菌株，通過先前描述的方法測(cè)定可誘導(dǎo)的ATR。所有ATR實(shí)驗(yàn)在補(bǔ)充了20 mM葡萄糖的TYE培養(yǎng)基（使用40 mM磷酸-檸檬酸鹽緩沖液制備，pH分別為7.5、5.5和3.5）中進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，通過將1體積過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到9體積（1:10）新鮮TYEG（pH 7.5）中，并在37°C、5% CO?氣氛中培養(yǎng)2小時(shí)來制備對(duì)數(shù)中期細(xì)胞。這些細(xì)胞通過在10,000 x g下離心10分鐘收集，并重懸于2 ml新鮮TYEG（pH 5.5）中，濁度為0.6（A600）。通過在37°C、5% CO?條件下孵育2小時(shí)來誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行酸適應(yīng)。然后將適應(yīng)的對(duì)數(shù)期細(xì)胞暴露于預(yù)確定的致死pH 3.5（通過將未適應(yīng)的對(duì)數(shù)中期細(xì)胞在pH值從6.0到2.0的TYEG中培養(yǎng)3小時(shí)來確定）。立即從每個(gè)樣品中取一份細(xì)胞懸浮液以確定零時(shí)的總活細(xì)胞數(shù)，并將培養(yǎng)物在37°C、5% CO?條件下孵育3小時(shí)。孵育后，取一份細(xì)胞懸浮液通過活菌計(jì)數(shù)確定存活百分比。ATR表示為在致死pH下存活3小時(shí)的細(xì)胞百分比。
酸適應(yīng)期間細(xì)胞的1?C標(biāo)記。 通過將細(xì)胞暴露于1?C標(biāo)記的氨基酸，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和二維凝膠電泳分離，來評(píng)估NG8和SMHK11在酸適應(yīng)過程中蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。將NG8和SMHK11的三個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)物在由六種氨基酸（谷氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、亮氨酸和天冬酰胺）、40 mM磷酸-檸檬酸鹽緩沖液（pH 7.5）和20 mM葡萄糖組成的最小培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)中期（600 nm處光密度= 0.7），在不含葡萄糖和緩沖液的培養(yǎng)基中洗滌兩次，并重懸于2.5 ml新鮮最小培養(yǎng)基中，濃度為2 x 10? 細(xì)胞/ml。將每個(gè)菌株的三份培養(yǎng)物分成兩部分，一部分暴露于pH 5.5，另一部分保持在pH 7.5，并存在150μCi的1?C-氨基酸混合物。在37°C下孵育30分鐘，通過向每個(gè)管中加入2 mg氯霉素停止蛋白質(zhì)合成。離心細(xì)胞（15,000 xg，10分鐘）并洗滌（使用10 mM Tris-HCl, pH 6.8，含1 mM EDTA和5 mM MgSO?）。將細(xì)胞儲(chǔ)存在-20°C，并使用超聲處理（在玻璃珠存在下）制備用于二維凝膠電泳的細(xì)胞蛋白提取物，如先前所述。
二維凝膠電泳和蛋白質(zhì)圖譜圖像分析。 二維凝膠電泳和放射自顯影圖像分析采用先前描述的方法進(jìn)行。第一維等電聚焦在線性pH 4至7的18厘米固定化pH梯度凝膠條上進(jìn)行，上樣量為10? cpm，對(duì)應(yīng)于150μg細(xì)胞蛋白。第二維分離使用14%聚丙烯酰胺梯度凝膠（185 x 200 x 1.0 mm）進(jìn)行，干燥的凝膠暴露于X射線膠片14天。放射自顯影上可視化的蛋白質(zhì)使用Bio Image軟件（版本6.1）在Sun Sparc工作站上進(jìn)行分析。如果酸暴露細(xì)胞（pH 5.5）與對(duì)照細(xì)胞（pH 7.5）相比，相對(duì)積分光強(qiáng)度變化超過兩倍，則將該蛋白質(zhì)點(diǎn)分類為差異表達(dá)。進(jìn)行了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)；對(duì)每個(gè)點(diǎn)計(jì)算了變異系數(shù)；那些表現(xiàn)出高固有表達(dá)變異的蛋白質(zhì)被排除為酸應(yīng)激蛋白。
顯微鏡檢查。 為了通過掃描電子顯微鏡檢查生物膜的空間分布和結(jié)構(gòu)，將聚苯乙烯微孔板表面形成的生物膜用10 mM磷酸鹽緩沖鹽水洗滌一次，通過加入2 ml 3.7%甲醛（溶于10 mM磷酸鹽緩沖鹽水）固定，并在室溫下孵育24小時(shí)。然后通過一系列乙醇沖洗（30%、50%、70%、95%和100%）對(duì)樣品進(jìn)行脫水，并用液態(tài)CO?進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥。將孔底表面切下，安裝并進(jìn)行金濺射鍍膜。然后使用掃描電子顯微鏡（型號(hào)S-2500；Hitachi Instruments, San Jose, Calif.）檢查樣品。
我們之前觀察到，變形鏈球菌中由comC基因編碼的CSP激活了一個(gè)未表征的第二途徑，該途徑似乎與細(xì)胞分離或鏈形成有關(guān)。由CSP激活的第二途徑仍有待確定。為了測(cè)試由hk/rr11編碼的TCSTS是否可能是第二途徑，我們通過光學(xué)顯微鏡比較了在添加或不添加CSP的情況下，hk/rr11突變體在生物膜中形成的鏈長(zhǎng)度。簡(jiǎn)而言之，使用先前描述的方法在微孔板中培養(yǎng)突變體生物膜，不同之處在于每個(gè)孔含有一個(gè)滅菌的蓋玻片作為底物，并且培養(yǎng)物補(bǔ)充了1.0μg/ml新鮮CSP。生物膜在SDM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)16小時(shí)，然后移除液體。然后將生物膜用0.1%結(jié)晶紫染色1分鐘，然后放在顯微鏡載玻片上。然后通過光學(xué)顯微鏡（Olympus CH30RF100; Tokyo, Japan）觀察生物膜并定性評(píng)估細(xì)胞鏈長(zhǎng)度。
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