2.3接種量對(duì)B.safensis生長(zhǎng)及其產(chǎn)CA的影響
接種量對(duì)B.safensis生長(zhǎng)及其產(chǎn)CA活性的影響如圖3所示。接種量對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響無(wú)顯著差異，均在36 h達(dá)到峰值，其中接種量為2%時(shí)，菌液OD???值最高，為4.36。接種量為2%時(shí)，在12~60 h培養(yǎng)期內(nèi)，CA的活性逐漸升高，60 h達(dá)到峰值。結(jié)果表明，在接種量為2%條件下更有利于B.safensis生長(zhǎng)和獲得高活性的CA。
圖3接種量對(duì)B.safensis生長(zhǎng)與CA活性的影響
a:生長(zhǎng)曲線；b:酶活曲線
2.4培養(yǎng)溫度對(duì)B.safensis生長(zhǎng)及產(chǎn)CA的影響
如圖4所示，隨著溫度升高，B.safensis生長(zhǎng)加快，到達(dá)30℃最適溫度后，其生長(zhǎng)開始減慢，而在60℃時(shí)幾乎不生長(zhǎng)，這可能是高溫對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸等發(fā)生了不可逆的傷害。在35~45℃條件下，細(xì)菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OD值最低，為2.31。與30℃相比，在35、40和45℃條件下，細(xì)菌數(shù)量分別在培養(yǎng)60、36、36 h后急劇下降，但其產(chǎn)CA的活性反而明顯提高，其中溫度為45℃時(shí)的酶活最高，60 h時(shí)的酶活約是30℃時(shí)的4.76倍。
圖4培養(yǎng)溫度對(duì)B.safensis生長(zhǎng)與CA活性的影響
a:生長(zhǎng)曲線；b:酶活曲線
為了驗(yàn)證B.safensis胞內(nèi)是否產(chǎn)CA及溫度對(duì)CA活性的影響，在接種量為2%、培養(yǎng)基初始pH值為7.0、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下，設(shè)置培養(yǎng)溫度為30、45℃，培養(yǎng)時(shí)間為84 h，定期檢測(cè)其胞外及總CA的活性，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，總CA的活性均高于胞內(nèi)CA，表明B.safensis產(chǎn)胞內(nèi)CA。溫度為45℃、培養(yǎng)時(shí)間為60 h時(shí)，總CA的活性和胞內(nèi)CA活性均達(dá)到最高。而且培養(yǎng)溫度為45℃的總CA活性比30℃高5.7倍。
圖5培養(yǎng)溫度對(duì)B.safensis胞外和總CA活性的影響
2.5轉(zhuǎn)速對(duì)B.safensis生長(zhǎng)及其產(chǎn)CA的影響
在不同搖床轉(zhuǎn)速條件下，B.safensis生長(zhǎng)及其產(chǎn)CA的活性變化如圖6所示。細(xì)菌的生長(zhǎng)隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加而加快。當(dāng)轉(zhuǎn)速為120 r/min時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)速度較慢，分泌積累的CA活性較低；當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較大的剪切作用，對(duì)酶的活性產(chǎn)生抑制；當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)，CA活性最高，并在60 h達(dá)到最大值。
圖6轉(zhuǎn)速對(duì)B.safensis生長(zhǎng)與CA活性的影響
a:生長(zhǎng)曲線；b:酶活曲線
2.6金屬離子對(duì)B.safensis產(chǎn)CA的影響
金屬離子對(duì)B.safensis產(chǎn)CA活性的影響如圖7所示。結(jié)果表明，Zn2?、Mn2?、Ca2?、Mg2?均能提高CA活性的表達(dá)。其中，0.010 mmol/L Mn2?的作用最大，比對(duì)照組提高了2.6倍；0.010 mmol/L Zn2?和0.005 mmol/L Mg2?次之，分別比對(duì)照組提高了1.59倍和1.69倍；0.005 mmol/L Ca2?也使CA的活性略有增加。而Cd2?對(duì)CA活性幾乎沒(méi)有影響，Co2?會(huì)抑制CA活性。
圖7金屬離子對(duì)B.safensis CA活性的影響
2.7最佳培養(yǎng)條件下B.safensis生長(zhǎng)及其產(chǎn)CA特性
在最佳培養(yǎng)條件下，B.safensis生長(zhǎng)及其產(chǎn)CA特性如圖8所示。細(xì)菌幾乎無(wú)生長(zhǎng)遲滯期，快速進(jìn)入對(duì)數(shù)期，24 h達(dá)到生長(zhǎng)最大值，說(shuō)明該菌株對(duì)環(huán)境具有很好的適應(yīng)能力。24 h后細(xì)菌生長(zhǎng)速度趨于平緩，進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，36 h后生長(zhǎng)速度開始急劇下降，進(jìn)入凋亡期。在12~60 h，CA活性逐漸升高，60 h達(dá)到峰值2.46 U/mL。60 h后CA活性逐漸降低，這可能是由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，毒性產(chǎn)物（OH）的積累，其他蛋白酶的產(chǎn)生或抑制CA活性的胞外代謝物等原因造成的。
圖8最佳培養(yǎng)條件下B.safensis生長(zhǎng)曲線與CA活性曲線
a:生長(zhǎng)曲線；b:酶活曲線
3討論
掌握細(xì)菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)CA特性，對(duì)獲得高活性酶液具有重要的意義。為了探明培養(yǎng)條件對(duì)B.safensis生長(zhǎng)及其產(chǎn)CA的影響，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定了其產(chǎn)高酶活性CA的最佳培養(yǎng)條件。研究發(fā)現(xiàn)B.safensis產(chǎn)高酶活性CA的最佳培養(yǎng)條件與其最佳生長(zhǎng)條件并不完全一致。該菌株在30℃條件下生長(zhǎng)最快，而45℃時(shí)產(chǎn)CA的酶活性最高；在培養(yǎng)24 h時(shí)細(xì)菌生物量最大，但進(jìn)入衰亡期（60 h）CA酶活性最大。微生物在適宜的生長(zhǎng)環(huán)境下，生長(zhǎng)迅速、代謝旺盛。Zheng等和Kaur等的研究表明B.mucilaginosus與B.megaterium的生長(zhǎng)和產(chǎn)高酶活性CA的培養(yǎng)條件均一致，且生物量最大時(shí)酶活性最高。本研究中，通過(guò)總CA活性檢測(cè)，證實(shí)B.safensis具有產(chǎn)胞內(nèi)CA的能力。當(dāng)溫度升高或細(xì)菌進(jìn)入衰亡期，菌體自溶導(dǎo)致了胞內(nèi)CA外排，使總CA活性增高。因此，充分利用細(xì)菌胞內(nèi)CA，獲得高酶活性的酶液具有重要的實(shí)際意義。李為通過(guò)研磨破裂細(xì)菌細(xì)胞獲得胞內(nèi)CA。本研究采用細(xì)菌細(xì)胞裂解液裂解細(xì)菌，使細(xì)菌胞內(nèi)CA釋放，便于對(duì)胞內(nèi)CA的進(jìn)一步利用。
CA促進(jìn)CO?水合反應(yīng)的核心機(jī)理是金屬離子對(duì)CO?的親核攻擊。因此，金屬離子對(duì)CA活性影響顯著。目前通常使用Zn2?作為輔助因子，激活CA活性。然而，在已發(fā)現(xiàn)的9種不同基因水平上的CA（α-、β-、γ-、δ-、ε-、ζ-、η-、θ-、ι-CA）中，雖然其結(jié)構(gòu)相似度不高，但每種CA的活性中心都會(huì)結(jié)合一個(gè)對(duì)催化過(guò)程起著重要作用的金屬離子。α-、β-、η-、θ-CA均以Zn2?作為輔助因子；γ-CA以Zn2?、Fe2?、Co2?作為輔助因子；δ-CA以Zn2?、Co2?作為輔助因子；ζ-CA以Zn2?、Cd2?作為輔助因子；ι-CA以Mn2?作為輔助因子；而ε-CA的輔助因子至今未見報(bào)道。為了探明B.safensis產(chǎn)CA的輔助因子，研究了Zn2?、Co2?、Cd2?、Mn2?、Mg2?、Ca2?等金屬離子對(duì)酶活性的影響。結(jié)果表明Mn2?對(duì)B.safensis CA活性的激活作用最顯著。最近，Jensen等從Thalassiosira pseudonana中鑒定了一種以Mn2?作為CA輔助因子的新型ι-CA。推測(cè)獲得的B.safensis菌株也可能產(chǎn)ι-CA。
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