酶譜法
使用含有共聚酪蛋白的8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠對(duì)藤黃微球菌B1pz濃縮培養(yǎng)液進(jìn)行酶譜分析，揭示了三個(gè)活性條帶的存在（圖5）。每種肽酶都表現(xiàn)出高分子量，分別為229 kDa、185 kDa和139 kDa。明膠酶譜法暴露了一個(gè)額外的62 kDa活性條帶。
羽毛肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)期間硫化合物的積累
已知角蛋白底物的微生物利用受到化學(xué)或酶學(xué)因子還原潛力的支持。在培養(yǎng)條件下羽毛的降解和富含半胱氨酸的羽毛角蛋白的水解導(dǎo)致不同氧化水平的硫化合物積累（圖6）。主要的硫形式是硫酸鹽，達(dá)到7.8 mM的水平，高于培養(yǎng)基組成中最初存在的濃度，其峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)的第7天，緊隨角蛋白酶最大生產(chǎn)期之后。也檢測(cè)到顯著存在的亞硫酸鹽，濃度低一倍，其釋放呈持續(xù)增加趨勢(shì)。還原性硫醇和硫代硫酸鹽的濃度保持在相對(duì)較低的水平，但在整個(gè)培養(yǎng)過程中累積到接近0.1 mM的水平。
二硫鍵還原酶活性
二硫鍵還原酶活性可能是在細(xì)菌生長(zhǎng)過程中支持角蛋白底物中二硫鍵蛋白水解斷裂的一個(gè)因子。在本實(shí)驗(yàn)中，在培養(yǎng)第4天的上清液中未檢測(cè)到二硫鍵還原酶活性，而此時(shí)積累的硫醇和角蛋白分解活性水平最高。然而，在細(xì)胞勻漿部分中測(cè)定出5.40 U的活性。上清液離心后，活性下降至僅0.32 U，暗示所測(cè)試的酶具有膜結(jié)合性質(zhì)（數(shù)據(jù)未顯示）。
存在還原性硫化合物情況下的細(xì)菌生長(zhǎng)和角蛋白酶生產(chǎn)
還原劑無疑在微生物角蛋白分解中起作用，因此，分析了在培養(yǎng)環(huán)境或反應(yīng)混合物中引入額外還原劑的可行性。在標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)肉湯的微培養(yǎng)中，濃度為0.5-1 mM的半胱氨酸對(duì)最大比生長(zhǎng)速率以及最大生物量產(chǎn)量影響很小。相反，1-5 mM的2-巰基乙醇或每種化合物在5 mM濃度下顯著損害細(xì)胞生長(zhǎng)。。1 mM好的，我們繼續(xù)翻譯文檔剩余的部分。
亞硫酸鹽和1 mM的二硫蘇糖醇，盡管延長(zhǎng)了延滯期并輕微惡化了生長(zhǎng)速率，但并未嚴(yán)重降低菌株的生物量生產(chǎn)（表3）。在補(bǔ)充了1 mM選定還原劑的羽毛培養(yǎng)基中進(jìn)行燒瓶培養(yǎng)，對(duì)角蛋白酶和蛋白酶生產(chǎn)的分析揭示了不同的效果（圖7）。蛋白水解活性水平在亞硫酸鹽、二硫蘇糖醇，尤其是半胱氨酸存在的情況下均顯著降低。角蛋白酶的生產(chǎn)也受到亞硫酸鹽和二硫蘇糖醇的負(fù)面影響，然而，添加半胱氨酸導(dǎo)致角蛋白分解活性增加了50%。盡管如此，在給定濃度下，沒有一種化合物能增強(qiáng)羽毛的降解。
| 還原劑 | 延滯期[h] | μmax[h?1] | ODmax |
| 對(duì)照 | 2 | 0.198 | 1.868 |
| 半胱氨酸 | 2.5 | 0.132 | 1.764 |
| 亞硫酸鹽 | 3 | 0.084 | 1.619 |
| 二硫蘇糖醇 | 6 | 0.097 | 1.694 |
| 谷胱甘肽 | 3 | 0.180 | 1.533 |
| 2-巰基乙醇 | 3 | 0.095 | 1.648 |
表3-藤黃微球菌B1pz在存在還原劑（1 mM）的營(yíng)養(yǎng)肉湯上的生長(zhǎng)情況。
還原性硫化合物對(duì)粗培養(yǎng)液中角蛋白酶在天然羽毛上活性的影響
在涉及藤黃微球菌B1pz無細(xì)胞粗培養(yǎng)液的對(duì)天然羽毛的反應(yīng)過程中，觀察到了額外還原因子的明顯積極效果（圖8）。1 mM半胱氨酸的存在導(dǎo)致角蛋白分解活性提高了125%，其次是二硫蘇糖醇和2-巰基乙醇，而亞硫酸鹽則對(duì)角蛋白水解產(chǎn)生負(fù)面影響。
討論
一種從禽類羽毛廢棄物中分離的蛋白酶生產(chǎn)菌，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育鑒定為藤黃微球菌（Micrococcus luteus）物種的成員，并對(duì)其角蛋白分解潛力進(jìn)行了探究。其有效降解羽毛角蛋白的能力得到證實(shí)，并揭示了所產(chǎn)角蛋白酶總體活性高于酪蛋白分解蛋白酶的罕見特性。最高的角蛋白酶生產(chǎn)發(fā)生在存在1-2%羽毛角蛋白以及添加培養(yǎng)基補(bǔ)充劑如酵母提取物或蛋白胨的情況下，這一點(diǎn)至關(guān)重要。這與關(guān)于多種角蛋白降解放線菌和其他細(xì)菌（包括芽孢桿菌屬）的大多數(shù)報(bào)告相符。通常需要少量蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑來支持在難降解角蛋白上的初始生長(zhǎng)，并且增加角蛋白底物濃度會(huì)對(duì)生長(zhǎng)和角蛋白酶生產(chǎn)產(chǎn)生不利條件。然而，重要的是，藤黃微球菌B1pz即使在羽毛作為唯一營(yíng)養(yǎng)源的培養(yǎng)基中也能進(jìn)行適度生長(zhǎng)和酶生物合成，這驗(yàn)證了其角蛋白分解的特性。此外，蛋白酶生產(chǎn)動(dòng)態(tài)與玫瑰色庫(kù)克菌（Kocuria rosea）相當(dāng)。該菌株的角蛋白分解潛力也在各種角蛋白附屬物上進(jìn)行的短暫4天培養(yǎng)中進(jìn)行了測(cè)試。藤黃微球菌的水解作用主要針對(duì)禽類羽毛或表皮角質(zhì)層的"軟"角蛋白，而不是其他"硬"角蛋白。毛發(fā)型附屬物由于其極其堅(jiān)韌的結(jié)構(gòu)，仍然不易被生物降解，但仍然是有效的角蛋白酶誘導(dǎo)物。
藤黃微球菌B1pz的角蛋白分解和蛋白水解酶似乎是主要為絲氨酸和硫醇蛋白酶的混合物，具有總體堿性最適條件。這類似于來自微球菌科的玫瑰色庫(kù)克菌的情況，其產(chǎn)生的角蛋白酶對(duì)EDTA較不敏感。酶譜分析揭示了兩個(gè)主要活性條帶的存在，分別為90 kDa和超過200 kDa，這與藤黃微球菌B1pz獲得的結(jié)果相關(guān)，顯示了一個(gè)62 kDa的低分子量蛋白酶部分和另外三個(gè)高于139 kDa的蛋白酶。對(duì)玫瑰色庫(kù)克菌角蛋白酶的進(jìn)一步純化使得能夠展示一種240 kDa的酶，其在40°C和pH 10下具有最佳活性。絕大多數(shù)細(xì)菌角蛋白酶屬于低分子量絲氨酸蛋白酶。通常，蛋白水解酶的高分子量?jī)H限于同多聚體結(jié)構(gòu)，例如海島熾熱桿菌（Fervidobacterium islandicum）中由97 kDa亞基組成的>200 kDa角蛋白酶復(fù)合物，或超嗜熱海床熱袍菌（Thermotoga maritima）中由31 kDa亞基組成的>669 kDa復(fù)合物，然而玫瑰色庫(kù)克菌的角蛋白酶仍然是一個(gè)單一的蛋白質(zhì)部分。
人們提出了不同的機(jī)制來解釋角蛋白的微生物分解，其中在蛋白水解分解之前斷裂二硫鍵是固有的。一種模式基于胱氨酸的亞硫酸裂解，通過細(xì)胞作為從角蛋白衍生的過量硫而排泄的亞硫酸鹽進(jìn)行。這主要在角蛋白分解絲狀真菌和放線菌中描述，但在一些細(xì)菌中也是可能的。另一種模式涉及通過特定的還原酶樣酶進(jìn)行直接還原，導(dǎo)致還原性硫醇的積累，這已在幾種細(xì)菌菌株中得到證實(shí)。
微生物分離株的角蛋白分解潛力通常從生長(zhǎng)環(huán)境中的角蛋白分解和角蛋白酶對(duì)角蛋白底物的活性兩方面來考慮。生長(zhǎng)環(huán)境中還原因子的存在常常被討論為角蛋白利用中的一個(gè)影響因素。對(duì)于測(cè)試的藤黃微球菌，在羽毛培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，證實(shí)了二硫鍵還原酶活性的存在，但主要存在于細(xì)胞勻漿部分中，而不是在培養(yǎng)液中。還原酶的膜結(jié)合位置是最典型的，正如Bockle和Moller針對(duì)S.pactum或Ramnani等人針對(duì)地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）所強(qiáng)調(diào)的那樣。然而，Yamamura等人和Prakash等人分別針對(duì)嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas sp.）和耐鹽芽孢桿菌（B.halodurans）的報(bào)告，證明了在羽毛肉湯培養(yǎng)期間存在細(xì)胞外二硫鍵還原酶。藤黃微球菌在羽毛培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物也測(cè)試了硫化合物如硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽和硫醇的水平。硫酸鹽作為硫排泄的最氧化形式，以最高濃度產(chǎn)生，然而這種化合物在亞硫酸裂解中不起作用。相比之下，亞硫酸鹽作為硫酸鹽的代謝前體，在整個(gè)15天的培養(yǎng)過程中累積到0.8 mM的水平，已知是二硫鍵還原的重要支持。Cedrola等人報(bào)告了在羽毛培養(yǎng)基中地衣芽孢桿菌SLC的8天培養(yǎng)物中亞硫酸鹽水平略有降低（0.15 mM），而Ramnani等人證實(shí)了地衣芽孢桿菌RG1培養(yǎng)物中亞硫酸鹽的存在。
還原性硫化合物即使在低濃度下也可能對(duì)細(xì)胞代謝有害，因此，測(cè)試了這些組分補(bǔ)充對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和角蛋白酶生產(chǎn)的影響。使用Bioscreen C對(duì)無羽毛營(yíng)養(yǎng)肉湯中的微培養(yǎng)進(jìn)行分析，證實(shí)了大多數(shù)硫化合物的抑制作用，然而在1 mM濃度下，抑制水平是適度的，因此可以接受用于進(jìn)一步探究。因此，將選定的還原化合物在1 mM濃度下：亞硫酸鹽、半胱氨酸和二硫蘇糖醇引入含有羽毛的培養(yǎng)基中。只有半胱氨酸刺激了角蛋白酶的生產(chǎn)，但這可能部分是由于以較低的蛋白水解活性為代價(jià)的酶激活所致。其余試劑導(dǎo)致角蛋白酶和蛋白酶生物合成的顯著損害，同時(shí)伴隨著羽毛利用率的降低，從而得出結(jié)論：與還原劑對(duì)微生物細(xì)胞的有害影響相比，底物中的亞硫酸裂解程度是無效的。同樣，Cedrola等人（2012）通過向地衣芽孢桿菌培養(yǎng)物中添加0.1-1%的亞硫酸鹽，實(shí)現(xiàn)了明膠酶的刺激，但不是角蛋白酶的生產(chǎn)，并且羽毛降解略有增加。
此外，在涉及無細(xì)胞粗培養(yǎng)液的對(duì)天然羽毛的酶促反應(yīng)中測(cè)試了還原化合物的效果。角蛋白分解活性的顯著增強(qiáng)主要在半胱氨酸存在下實(shí)現(xiàn)，其次是二硫蘇糖醇和2-巰基乙醇，這是由于亞硫酸裂解效應(yīng)或蛋白酶激活。在幾個(gè)報(bào)告中發(fā)現(xiàn)了無細(xì)胞角蛋白酶對(duì)角蛋白水解的類似刺激，通常被認(rèn)為是完全底物降解的必要條件。為了在缺乏微生物細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)的情況下實(shí)現(xiàn)有效的角蛋白水解，角蛋白酶的蛋白水解作用需要二硫鍵還原化合物的支持。還原環(huán)境為角蛋白水解創(chuàng)造了有利條件，即使使用常規(guī)的、非角蛋白分解的蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶、Savinase、胰凝乳蛋白酶或木瓜蛋白酶。
由于藤黃微球菌B1pz菌株的初步表征證實(shí)了其角蛋白分解潛力，主要是針對(duì)生羽毛，因此需要進(jìn)一步研究以探究特定的蛋白酶和酶生產(chǎn)的詳細(xì)條件。盡管如此，所展示的分離株在禽類副產(chǎn)品的生物降解或作為蛋白質(zhì)飼料成分的角蛋白質(zhì)量?jī)r(jià)值改性方面都具有可行的應(yīng)用能力。
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