摘要
本研究開發(fā)了一個模型，用于預測產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（VTEC）在發(fā)酵生肉香腸（FRMS）整個加工和儲存過程中的種群密度。通過收集公開資源中的概率和動力學測量數(shù)據(jù)集，并在需要時補充新的測量數(shù)據(jù)，量化了VTEC生長和滅活對溫度、pH、水分活度（a_w）和乳酸濃度的依賴性。將預測結果與在中試工廠生產(chǎn)的VTEC污染FRMS中的觀察結果進行了比較。根據(jù)發(fā)酵溫度（24°C或34°C）預測了VTEC減少的微小差異，在最高溫度下滅活程度更大。在高溫儲存期間觀察到最大的減少。在25°C下儲存66天后，觀察到種群數(shù)量減少超過6個十進制對數(shù)單位，而在12°C下僅檢測到約1個對數(shù)單位的減少。評估了我們的模型和其他建模方法在干制和半干制FRMS加工過程中的性能。預測在干燥期長的干制FRMS中VTEC滅活程度最大，而在干燥期短的半干制FMRS中減少最小。該模型已在一個名為E.coli SafeFerment（EcSF）的計算工具中實現(xiàn)，EcSF整合了生長、生長概率、熱滅活和非熱滅活模型，以預測在恒定或波動的環(huán)境條件下FRMS制造和儲存過程中的VTEC濃度。
引言
產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（VTEC），包括血清型O157:H7，是引起人類嚴重食源性疾病的病原體。VTEC的一個亞群能夠引起出血性結腸炎（HC）和溶血性尿毒癥綜合征（HUS），構成腸出血性大腸桿菌（EHEC）。其中，一系列血清群（即O157、O26、O103、O91、O145和O111）與公共衛(wèi)生問題非常頻繁地相關。
牛是VTEC的主要儲存宿主。傳播主要通過食用未煮熟的受感染牛肉、未經(jīng)巴氏消毒的乳制品、蔬菜或受污染的水發(fā)生。也有報道人際傳播。與食源性大腸桿菌O157:H7暴發(fā)相關的劑量估計在2到2,000個細菌之間。如此低的劑量意味著這種微生物不需要在產(chǎn)品中生長就能引起疾病。在美國，VTEC每年估計導致260,000例疾病，3,700例住院和20例死亡。在歐洲，估計每年病例數(shù)約為3,000至4,000例。
發(fā)酵生肉香腸（FRMS）是通過發(fā)酵、干燥、香料、鹽、亞硝酸鈉以及Starter培養(yǎng)物活性產(chǎn)生乳酸并降低培養(yǎng)基pH值的組合來抑制病原菌生長和/或存活的產(chǎn)物。已報道了幾起涉及被VTEC污染的FRMS的食源性暴發(fā)。在歐盟，碎肉和/或發(fā)酵肉及其制品因可能受VTEC污染而被視為對公共衛(wèi)生構成危害。在美國，發(fā)酵香腸生產(chǎn)過程中要求大腸桿菌種群減少5個對數(shù)單位，而所需減少量為3個對數(shù)單位。
由VTEC引起的食源性暴發(fā)數(shù)量不斷增加，促使人們努力了解其在幾種環(huán)境條件下的種群動態(tài)，包括生長和衰減速率以及生長限制。預測食品中大腸桿菌和其他細菌種群動力學的模型可在幾個公共資源獲得，例如ComBase門戶網(wǎng)站、PMP或FoodRisk.org。大腸桿菌生長對環(huán)境的依賴性已在廣泛的食品條件下建模。在肉湯和包括FMRS在內的食品中也估計了大腸桿菌的生長/無生長邊界和滅活。具體來說，大腸桿菌O157:H7的滅活已被建模為由于Starter培養(yǎng)物和酵母在橄欖發(fā)酵過程中的代謝活動導致的培養(yǎng)基變化函數(shù)，以及作為pH和水分活度（a_w）在soudjouk式發(fā)酵香腸發(fā)酵和干燥過程中的函數(shù)。公開可用的軟件THERM根據(jù)生肉產(chǎn)品的時間-溫度歷史預測大腸桿菌O157:H7和其他病原體的生長或不生長；更具體地說，澳大利亞食品安全卓越中心提供了實現(xiàn)預測生肉中和發(fā)酵肉制品中大腸桿菌O157:H7滅活的工具。然而，預測VTEC在涵蓋FRMS制造和儲存特有的生長和無生長環(huán)境范圍內的響應尚未得到解決。
這項工作的目的是量化VTEC在FRMS制造和儲存條件下的響應，并開發(fā)一個用戶友好的動態(tài)建?？蚣軄眍A測這些過程中VTEC生物的濃度。我們在文獻和公開數(shù)據(jù)源中進行了廣泛搜索，涉及實驗室培養(yǎng)基和食品中不同溫度、pH、a_w和乳酸條件下的生長和滅活速率以及生長/無生長限制。此外，還實驗生成了新數(shù)據(jù)以解決數(shù)據(jù)空白，并在中試工廠制造了FRMS，以評估模型對制造和儲存過程中VTEC種群密度的預測。
為了促進模型的應用，它已被實現(xiàn)為一個名為E.coli SafeFerment（EcSF）的Excel加載項。EcSF工具結合了生長、生長概率和滅活模型，以預測在恒定或波動的環(huán)境條件下FRMS生產(chǎn)和儲存任何階段的VTEC濃度。
材料與方法
數(shù)據(jù)收集
用于開發(fā)VTEC模型的數(shù)據(jù)集來自ComBase數(shù)據(jù)庫或文獻，或由塔斯馬尼亞大學食品安全中心友好提供。本工作還生成了額外數(shù)據(jù)以解決數(shù)據(jù)空白（見補充材料中的表S1）。補充材料中的表S2顯示了公開數(shù)據(jù)和新生成數(shù)據(jù)中使用的血清型和菌株。
數(shù)據(jù)生成
(i)菌株、接種物和培養(yǎng)基制備
本工作使用兩種產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌菌株來測量非熱滅活速率，并在各種溫度、pH、a_w組合以及幾種乳酸濃度下生成生長/無生長觀察結果。這些是2006年挪威由含有羊肉牛肉（morr）的發(fā)酵香腸引起的暴發(fā)中涉及的O103:H25菌株，以及2002年瑞典由冷熏發(fā)酵香腸引起的暴發(fā)中涉及的O157:H7 218菌株。
使用先前構建并評估了在各種環(huán)境條件下實驗室培養(yǎng)基中生長和滅活的利福平抗性（Rif'）菌株大腸桿菌O157:H7 218Rif和O103:H25 Rif'來接種FRMS。在胰蛋白酶大豆肉湯（TSB;Oxoid,United Kingdom）和pH 5.5含10,000 ppm乳酸的TSB中評估了野生型和Rif突變菌株的生長；在pH 4.0、a_w值等于0.90含45,000 ppm乳酸的TSB中測量了滅活。在所有測試條件下，Rif菌株的生長和滅活響應與野生型菌株相同（數(shù)據(jù)未顯示）。
菌株培養(yǎng)物在-70°C下用20%甘油保存。實驗前，將野生型菌株的接種物在37°C的TSB中連續(xù)三次傳代培養(yǎng)24小時。Rif菌株接種物按先前描述制備。需要時，用6 N NaOH和1 N HCl無菌調節(jié)培養(yǎng)基pH，并在高壓滅菌前向培養(yǎng)基中加入乳酸（90.08 g/liter;90%acid）和NaCl。水分活度基于TSB中補充NaCl（已含0.5%），并根據(jù)方程a_{w}=-0.0071times percent NaCl+1.0054text{估計，如先前報道}。
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