發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件


微生物培養(yǎng)在250 mL錐形瓶中進(jìn)行，培養(yǎng)基體積為50 mL，溫度為30-45{}^{circ}C，搖床轉(zhuǎn)速170 rpm，培養(yǎng)4-15天。在550 nm波長下吸光度為0.2的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（葡萄糖1%，營養(yǎng)肉湯0.8%）用作接種物，每瓶使用1 mL。研究中使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成（%）：MgSO?0.1，KH?PO?0.01，CaCl?0.01，F(xiàn)eSO?·7H?O 0.001，補(bǔ)充有酵母提取物0.05，可選擇性地去除或替換為蛋白胨或葡萄糖/氯化銨。基本的碳源和氮源是完整的、脫脂的白雞羽毛（1-6%）或其他角蛋白材料（1%）。培養(yǎng)基調(diào)至pH 7.2，并在121°C下高壓滅菌20分鐘。


為了確定還原劑對(duì)角蛋白酶生產(chǎn)和羽毛降解的影響，使用含有酵母提取物0.05%和雞羽毛1%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并補(bǔ)充1 mM的亞硫酸鈉、二硫蘇糖醇或半胱氨酸。


還原劑對(duì)細(xì)胞生長的影響在Bioscreen C 微生物生長曲線分析儀（Labsystems）中測試，使用0.3 mL營養(yǎng)肉湯，補(bǔ)充有0.5或1 mM的亞硫酸鈉、二硫蘇糖醇、半胱氨酸、還原型谷胱甘肽或2-巰基乙醇。從獲得的生長曲線計(jì)算延滯期持續(xù)時(shí)間（lag）、最大比生長速率（μmax）和最大生物量（ODmax）。


酶學(xué)測定


所有測定均在收集的培養(yǎng)液中進(jìn)行，先通過Whatman 2號(hào)濾紙過濾去除羽毛碎片，然后在4°C下以10，000 g離心10分鐘。為了測定二硫鍵還原酶活性，也收集了細(xì)胞沉淀。


對(duì)可溶性角蛋白的角蛋白分解活性測定混合物包含：角蛋白溶液2 mg/mL（0.5 mL），Tris-HCl緩沖液0.05 M，pH 9.4（0.48 mL），培養(yǎng)液（0.02 mL），并在55°C下孵育15分鐘。反應(yīng)通過加入1 mL 8%三氯乙酸（TCA）終止?；旌衔锢鋮s30分鐘，以10，000 g離心10分鐘，并在280 nm波長下測量吸光度。一個(gè)單位的角蛋白分解活性（KU）定義為在1分鐘內(nèi)，每1 mL酶引起的TCA可溶性產(chǎn)物吸光度增加0.01?？扇苄越堑鞍赘鶕?jù)Wawrzkiewicz等人的方法制備，通過將羽毛溶解在沸騰的DMSO中并用丙酮（比例1:3）沉淀。


蛋白水解活性的測定如上所述，使用2%酪蛋白溶液作為底物，在45°C，pH 8.6下進(jìn)行反應(yīng)。一個(gè)單位的蛋白水解活性（PU）代表在1分鐘內(nèi)，每1 mL酶引起的吸光度增加0.01。


對(duì)天然雞羽毛的角蛋白分解活性測定混合物包含：精細(xì)切碎的羽毛100 mg，Tris-HCl緩沖液0.05 M，pH 9.4，含CaCl?5 mM和疊氮化鈉0.02%（8 mL）以及培養(yǎng)液（2 mL），在55°C下孵育4小時(shí)?？蛇x擇性地加入最終濃度為1 mM的還原化合物：半胱氨酸、亞硫酸鈉或二硫蘇糖醇。反應(yīng)通過加入10 mL 8%TCA終止?；旌衔锢鋮s30分鐘，通過Whatman 2號(hào)濾紙過濾，并以10，000 g離心10分鐘。在280 nm波長下測量吸光度。一個(gè)單位的角蛋白分解活性（KU/h）定義為在1小時(shí)內(nèi)，每1 mL酶引起的TCA可溶性產(chǎn)物吸光度增加0.01。


谷胱甘肽還原酶活性根據(jù)Carlberg和Mannervik的方法測定，在氧化型谷胱甘肽存在下，在NADPH存在下，于30°C在Tris-HCl緩沖液0.05 M，pH 7.0中進(jìn)行反應(yīng)。來自第四天培養(yǎng)的上清液，以及細(xì)胞勻漿或其離心后的上清液用作酶源。細(xì)胞勻漿通過將緩沖液洗滌并冷卻的細(xì)胞懸浮液超聲處理2分鐘（循環(huán)0.5秒開/0.5秒關(guān)）獲得?；钚员硎緸樵?分鐘內(nèi)，由1 mL（培養(yǎng)液部分）培養(yǎng)液或1 g干生物量（細(xì)胞勻漿部分）氧化的NADPH的微摩爾數(shù)。


分析測定


硫化合物根據(jù)以下方法測定：還原性硫醇-使用5，5'-二硫代雙-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）的Ellman方法；硫酸鹽-涉及氯化鋇的Kolmert等人的方法；亞硫酸鹽-Kletzin描述的使用品紅和甲醛的方法；硫代硫酸鹽-Sorbo的使用氰化鉀的方法。


培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)濃度根據(jù)Lowry的方法使用Folin-Ciocalteu試劑測定，游離氨基酸使用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）根據(jù)Snyder和Sobocinski的方法測定。



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